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要約

シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されましたイメージング Cエレガンス無傷ショウジョウバエ幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。デバイスは、心拍、細胞分裂や細胞内輸送などの多数の神経プロセスのタイムラプスイメージングを実行するために、これらのモデル生物を固定化するために変形されたPDMS膜を利用しています。我々は、この装置の使用方法を示す、別のモデルシステムから収集したデータの様々なタイプの例を示しています。

要約

マイクロ流体デバイスを作製は、小さな生物に関するin vivo研究のためのアクセス可能な微小環境を提供します。シンプルな製造プロセスは1-3ソフトリソグラフィ技術を用いて、マイクロ流体デバイスのために用意されています。マイクロ流体デバイスは、 生体内レーザー顕微2,6と細胞イメージング4,7 のサブ細胞イメージング4,5、のために使用されている。in vivoイメージング生物の固定化を必要とします。これは、吸引5,8を使用して達成されている、先細チャネル6,7,9、変形可能な膜2-4,10、追加の冷却5、麻酔ガス11、温度感受性ゲル12、シアノアクリレート接着剤13や14のような麻酔レバミゾールと吸引、15。一般的に使用される麻酔薬は、シナプス伝達16,17に影響を与え、細胞内神経輸送4に有害な影響を有することが知られている。本STにおけるudy我々はそのような線虫Caenorhabditis elegans（線虫C. elegans）、ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの幼虫のようにそのまま遺伝的モデル生物の麻酔フリー固定化を可能にするポリジメチルシロキサン（PDMS）装置による膜を実証している。これらのモデル生物は、それらの小さい直径および光学的に透明または半透明の体のマイクロ流体デバイスを用いたin vivo研究では適しています。本体の直径はCの初期の幼虫のために約10μmから約800μmの範囲虫やゼブラフィッシュ幼生と高解像度タイムラプスイメージングのための完全な固定化を達成するために、異なるサイズのマイクロ流体デバイスを必要とします。これらの生物は、液体カラムを通して圧縮窒素ガスによる圧力を用いて固定し、倒立顕微鏡を用いて結像​​される。トラップから解放動物が10分以内に通常の歩行に戻ります。

我々は、Cのタイムラプスイメージングの4つのアプリケーションを実証エレガンスすなわち、神経細胞におけるイメージングミトコンドリア輸送、輸送欠損変異株、グルタミン酸受容体輸送とQ神経芽細胞の細胞分裂における前シナプス小胞輸送。映画などから得られたデータは、マイクロ流体固定化は麻酔動物（ 図1Jと3C-F 4）と比較した場合、携帯電話とサブ細胞事象のin vivoデータ取得の有用かつ正確な手段であることを示している。

デバイスの寸法は Cの様々な段階のタイムラプスイメージングを可能にするように変更されました線虫 、 ショウジョウバエの初齢幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。感覚神経細胞にGFP（syt.eGFP）でタグシナプトタグミンでマーク小胞の輸送はそのまま初齢ショウジョウバエの幼虫のコリン作動性感覚神経細胞で発現シナプス小胞マーカーの指示の動きを示しています。似たようなデバイスが〜30時間後に受精（HPF）でハートビートのタイムラプスイメージングを行うために使用されています幼虫をゼブラフィッシュ。これらのデータは、我々が開発したシンプルなデバイスが生体内でいくつかの細胞生物学的および発達現象を研究するためのモデルシステムの様々に応用できることを示す。

プロトコル

1。 SU8マスター作製

  1. Clewinソフトウェアを使用して、マイクロ流体構造を設計し、回路基板フィルム上に8μmの最小特徴サイズで65024 dpiのレーザープロッターを使用してそれを印刷してください。
  2. 1分間、20％KOH中で自然酸化で2センチ×2cmのシリコンウエハをきれいにし、脱イオン水ですすぎ、流れの層とそれに対応する制御層用ウェーハ各1。
  3. 窒素ガスでピースを乾燥させ、4時間120℃のホットプレート上で脱水吹く。作品は次のステップに進む前に室温まで冷却することができます。
  4. 場所シリコン片スピナーチャック上を1つずつ真空の電源をオンにします。 〜20μlのヘキサメチルジシラザン（HMDS）とコート入れ、5 500rpmでSPIN150スピンナーを用い有するシリコン表面を覆う秒30秒間3000rpmで続く。
  5. SU8-2025（の〜1.5mlで完全にシリコンウエハをカバーします。http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm）と5秒間500rpmでSPIN150スピンナーを用いて塗布ウェーハは30秒間2,000 rpmで続く。この紡績プロトコルは、Cの初期の幼生期の制御とフロー層に適しています〜40μmのレジスト膜厚を生成エレガンス 。
  6. スピン5〜500rpmでSPIN150スピンナーを用いて1.5ミリリットルSU8-2050秒での後期幼虫用の流層の製造に適しています〜80μmのレジスト膜厚を得るために30秒間2,000 rpmで続く虫 、 ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生およびそれらに対応する制御層のための基底流量層。
  7. 上にSU8被覆層とのホットプレート上でシリコン片を置きます。ソフトベーク65で被覆されたシリコン片℃で10分間、95℃、続いて1分間。作品は次のステップに進む前に室温まで冷却することができます。
  8. SU8-2025コーティングされたシュールで露光ステージ上のソフトで焼いたシリコン片を置きUVランプが直面している一番上の顔。 Cの初期の幼虫のためにそれぞれフロー層と制御層パターンの設計I（L1、 図1B）とデザインⅡ（L2は、 図1B）と、フォトマスクを使用エレガンス 。 SU8層の上にフォトマスクを置き、マスクが被覆層に対して平らであることを確認します。 UVランプのシャッターを開けて、15秒間、フォトマスクを介して200ワットのUVランプにソフト焼きSU8ウェハを公開します。
  9. Cの後期幼生期のための流層と制御層を作製する（ステップ1.6で調製した）SU8-2050コーティングされた部分で設計I（L1、 図1B）とデザインⅡ（L2は、 図1B）と、フォトマスクを使用エレガンス 。 SU8-2050（準備された私でコーティングされたウェーハ上ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュの幼虫のためにそれぞれ基底流層と制御層の設計I（L1、 図1C）とデザインⅡ（L2は、 図1C）でフォトマスクを使用して、nステップ1.6）。 15秒200ワットのUVランプにフォトマスクを介してSU8表面を露出。
  10. 上に被覆層を備えたホットプレート上に露出したシリコン片を置きます。 10分間95℃に続いて1分間、65℃でウェハを焼く投稿してください。作品は次のステップに進む前に冷却することができます。
  11. 20分間SU8現像液を使用した作品を開発しています。 iso-プロピルアルコール（IPA）のピースを洗浄し、乾燥した使用して窒素ガスを吹き付ける。
  12. 上にSU8パターンでデシケーター中でシリコン片を置きます。 tricholoro50μlの（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン2時間デシケーター中で蒸気でコート部分を。

注意事項：KOH処理、レジスト塗布現像中に化学処理のための安全対策を講じて下さい。シラン蒸気コーティングは、換気の良い場所にデシケーター内で行われるべきである。 SU8は、光への暴露の上からレジストを保護します。紫外線LIGと保護メガネを使用して、htのソース。

2。 PDMSモールドの作製

  1. プラスチックカップの硬化剤5gでシルガード184ベースの50グラムを組み合わせることにより、10時01 PDMSを準備します。 〜3分間手動でコンテンツを混ぜる。ドガ、混合中に形成された全ての気泡を除去するためにデシケーター内部の混合物。
  2. 気泡の形成を回避するために優しく、制御層のために、設計IIのSU8パターンをシリコンウェハ上に厚さ5mmのPDMS混合物を注ぐ。場合には気泡がすべての気泡を除去するために、低真空でSU8パターン上に、ドガPDMSを注ぐ中に形成される。
  3. 私はスピナーチャック上に、フロー層のために、デザインのSU8-2025パターンでシリコンウェーハを置き、それらを保持するために真空をオンにします。 〜1 PDMSミックスのmlおよびコート5 500rpmでSPIN150スピンナーを用いてウエハをウエハをカバー秒30秒を1,500 rpmに続く。
  4. コート〜の設計I（L1、 図1B）の80μmのSU8-2050パターン付きシリコンウエハ上の1ミリリットルのPDMSミックスCの後期幼生期のためのフロー層5秒間500rpmでSPIN150スピンナーを用いelegansは 30秒間1,000 rpmで続く。コート35秒500rpmでSPIN150スピンナーを用いてショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生に対するフロー層設計I（L1、 図1C）のSU8-2050パターン付きシリコン片、上のPDMSミックスの厚い層。
  5. デザインのオーブンで焼くPDMSコーティングされたシリコン片IおよびCに対してPDMSを含む制御層に対応する設計IIとウェハ50℃の熱風対流式オーブンでエレガンス 、そして/またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生℃で6時間インキュベートする。
  6. CのSU8パターンIIを含むシリコン基板からのPDMS部分をカット鋭い刃を使用して線虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。ハリスのパンチャーを使ってPDMSモールドのメイントラップを接続する貯水池の上に約1mm径の小さな穴を開ける。
  7. パンチPDMSブロックを（制御用厚さ40μmの金型を含む置き上向きに制御層の成形面をプラスチックトレイの上に層L2）。 PDMSの塗布面を上向きにして、同じトレイに厚さ40μmSU8デザイン私を含むPDMSコーティングされたシリコンウエハを配置します。プラズマクリーナーのチャンバ内のトレイを挿入し、2分間、真空をオンにします。その後、プラズマ電源をオンにし、チャンバの色は薄いピンクを回すまでチャンバ圧力を下げる。 2分間の低真空下で18ワット空気プラズマに両面を公開します。
  8. Cの後期幼生期のために厚さ80μmSU8マスター含むパターンIIから削除パンチPDMSブロックを配置上向きに制御層の成形面をプラスチックトレイに虫やショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。後でCの厚さ80μmデザインIを含有するシリコンウェーハ上に塗布し、対応焼きPDMS層のスピンを置く虫のステージやフラットPDMSコーティングされたのと同じトレイに同時にショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生urfaceは上向き。空気プラズマにさらさ上記の同じプロトコルを使用します。
  9. Cの2つのプラズマ処理された表面を置き虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生一緒に穏やかな圧力で、50℃の熱風対流式オーブンで焼く℃で2時間インキュベートする。
  10. CのSU8設計Iとシリコン基板から保税デバイスを切り取る虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。パンチアクセス流路の入口と出口貯水池の穴。
  11. C用のプラスチックトレイに結合PDMSモールドを配置上向きに流動層設計の成形側とエレガンス 。きれいなガラスカバースリップ（22×22ミリメートル、厚さ1号）と同じプラスチック製のトレイの上に置きます。 PDMSモールドとプラズマチャンバー内のガラスカバースリップを含むトレイを挿入します。底装置のPDMS表面と2分間、低圧で18ワットの空気プラズマにガラスカバースリップを公開します。 Genでは2プラズマ処理された表面を置きTLE圧力、2時間50℃でそれらの熱風対流式オーブンで焼く。
  12. 将来の使用のためのクリーンな環境に保管してください。

3。 ショウジョウバエ /ゼブラデバイスの追加手順

  1. サイズの清浄なガラス表面X 2センチメートルtricholoroの50μl（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン2時間デシケーター中で蒸気と2cmを公開します。
  2. スピン〜35秒500rpmでSPIN150スピンナーを用いてシラン化ガラス表面にステップ2.1で調製した10時01分のPDMSミックスの1ミリリットル。上向きにコーティングされた表面と6時間50℃の熱風オーブンでPDMSコーティングされたガラス基板を焼く。 PDMS層は、次の手順に進む前に室温まで冷却することができます。
  3. パンチのPDMSスペーサ層を形成するために、PDMSの中央にカスタム構築された鋭利な金属のパンチャーを使って被覆層。金属のパンチャーの形状は、 ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュのためのフロー設計（L1、 図1Cと同様に設計されている）。
  4. PDMSのスペーサ層と低真空でプラズマクリーナーを使用して単一の結合ブロック（ ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュの幼虫のためのステップ2.9で行われたフロー層と制御層）、18ワット空気プラズマにさらす。一緒に2つのプラズマ処理された表面に置き、50℃の熱風オーブンで焼く℃で2時間インキュベートする。
  5. ガラス、入口と出口の貯水池にパンチアクセスホールとステップ2.11で述べたように、プラズマクリーナーを使用してガラスカバースリップ（22×22ミリメートル、厚さ1号）に結合してから結合されたデバイスをカット。これは、〜500μmの流路高さと初齢ショウジョウバエの幼虫のための固定化装置を生産するでしょう。ゼブラフィッシュ幼生については、追加のボンディング工程とPDMSのスペーサ層製造プロセスを複製します。 PDMS-Sのデュアル層は30 HFPゼブラフィッシュの幼虫は900μmの流路高さを生成します。

注意事項：デバイス製造時にほこりを避けてください。 2つのプラズマ洗浄された表面sは完全に適切なボンディングのための無料の塵にする必要があります。特別なクリーンルームは、デバイス中のほこりの蓄積を最小限にするために利用できない状況で、デシケーター中でデバイスに保管してください。

4。 PDMS膜を用いた

  1. 18ゲージ針（外径〜1.25ミリメートル）を介して加圧された窒素ガス供給レギュレータとメイントラップ溜め、もう一方の端にマイクロフレックスチューブ（内径〜1.6ミリメートル、外径〜4.8ミリメートル）の一方の端を接続しますテレビ画面に釘付けになっている。チューブ接続の中間で使用3方活栓は、メンブレン上のアプリケーションまたは圧力の放出を可能にする。
  2. Cの主なトラップのリザーバーに接続する前に、蒸留水の10cmカラムとPDMS装置に接続されたチューブを埋める虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生デバイス。
  3. 14 psiを読んで、目に向かって偏向メイントラップの膜を監視するために窒素供給のバルブを回し倒立顕微鏡の低倍率で電子流路。マイクロフレックスチューブ内水柱の長さは3方活栓がオープンされている圧縮されています。偏向膜のエッジは透過光（ 図1Iと1J）に表示されます。膜のたわみは、PDMS膜下ダスト粒子/気泡の変位を引き起こし、チャネルの境界にプッシュします。
  4. 液体前面が閉じ込められた空気なしで完全にマイクロチャネルをいっぱいまで待ちます。
  5. その静止位置に膜を緩和する3方活栓を用いて圧力を解放します。

5。 Cを挿入線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュデバイスに幼虫と柔軟性PDMS膜の下でそれらを固定化

  1. 1 LにH 2 O M9バッファ[3グラムのKH 2 PO 4、6グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1ミリリットルの1M MgSO 4で流路を埋める、AUTで滅菌oclaving] Cに対してエレガンス 18または1×PBS前10分間ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生19日に[8 NaCl、0.2gのKCl、1.44gのNa 2 HPO 4、0.24gのKH 2 PO 4、H 2 O 1Lには、オートクレーブで滅菌する]を実験。
  2. シングルCを見つけ低倍率の実体顕微鏡を用いてのNGMプレート18（または寒天エッグプレートまたは液体培地で20手動dechorionated 30 HPFゼブラフィッシュの幼虫から初齢、ショウジョウバエの幼虫）で必要なステージの虫 。マイクロチップ内に緩衝液の少量を使用して、単一の動物を選んでください。バッファ内のより大きいショウジョウバエやゼブラフィッシュの幼虫を収容するために、その端部をカットしたマイクロチップを使用しています。
  3. 流路入口から単一の生物を押してください。メイントラップの下に個々の動物を位置決めするためのピペッティング圧力を調整します。
  4. ゆっくりちゃんに対して動物を配置するためのPDMS膜の圧力を増加させるNEL境界および Cの14 psiの圧力でそれを固定する線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュの幼虫の3 PSIの7 PSI。
  5. ビューの顕微鏡視野の中心に固定化された動物を置きます。高分解能明視野、蛍光イメージングのための希望の設定に倒立顕微鏡を使用しています。事前定義されたフレームレートで単一またはタイムラプス蛍光画像を取得する。
  6. トラップ圧力を解放し、低倍率で5〜10分間のために動物の運動を監視します。
  7. 動物をフラッシュして、上記の手順を繰り返して、新鮮な動物を挿入します。
  8. シリンジを使用して適用された蒸留水を用いた廃棄物のリザーバーからすべての動物を洗う。将来の再利用のための注射器を使用して空気を押してチャンネルを乾かします。

注意事項：メインチャネル内の流れに高いピペッティング圧力を必要とする動物は、トラップからのリリース後に貧しい運動/健康を示す傾向にあるとIMAは避けるべきである変更する。結晶することで、チャネルの詰まりを防止するためのバッファの任意のトレースの流路を清掃してください。油は高分解能イメージングのために使用されている場合は、その後の実験のために対雑音比の良い信号を維持できるようにするにはガラスカバースリップを清掃してください。

結果

図1に示すように、フロー層（レイヤ1）と制御層（レイヤ2）：固定装置は、接着層2で作製した二層のPDMSブロックです。主なトラップは、レギュレータと液柱（ 図1A）を介して膜上必要（3-14 psi）の圧力を適用するための3ウェイストップコックを介して窒素ガスボンベに接続されています。偏向膜は C を固定する異なる次元（ 図1Bおよび

ディスカッション

PDMSマイクロ流体デバイスは、したがって、任意の透明/半透明モデル生物のin vivoイメージング高分解能のために使用することができる光学的に透明である。当社のデザインはそのまま生きた動物における細胞およびサブ細胞事象の高倍率時空イメージングに適しています。ソフトリソグラフィ技術を用いて微細加工は、モデル生物の様々なサイズのためのデバイスの寸法を簡単に操作...

開示事項

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

我々は、CのnuIs25とCGCのためのピーター十王、 ショウジョウバエケージを維持するために、ショウジョウバエの株式、Tarjani Agarwalさんのために博士Krishanuレイに感謝エレガンス株。 SPKはマイケルノネの研究室でjsIs609を作った。我々は、マイクロ流体デバイスにおけるjsIs609動物のミトコンドリア輸送のタイムラプスイメージングで彼の助けArpan Agnihotri（BITSピラニ）に感謝。我々は、ゼブラフィッシュ胚を提供してくれるための博士VatsalaティルマとスーリヤPrakashさんに感謝しています。我々は、ナノテクノロジー（第SR/55/NM-36-2005）のための科学と技術 - センターの部門によってサポートされ回転するディスク共焦点顕微鏡の使用のNCBで博士クリシュナとCIFFに感謝します。我々はまた、議論のためKaustubh Rauさん、V. VenkatramanとChetana Sachidanandに感謝します。この作品は、DBTポスドクフェローシップ（SM）は、DSTのファスト·トラック制度（SM）とによる助成（SPK）によって賄われていた。 SAはSPKにDSTとCSIR補助金によって支えられている。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名称 会社 カタログ番号 コメント（オプション）
シリコンウェーハ大学ウェハ 150ミリメートル（100）メックグレードのSSPのSi
Clewinソフトウェア WieWebソフトウェアバージョン2.90
レーザープロッタファインラインイメージング 65024 DPI
HMDS シグマアルドリッチ 440191-100ML
SU8 マイクロケム SU8-2025、SU8-2050
開発者マイクロケム SU8開発
シランシグマアルドリッチ 448931-10G
PDMS ダウコーニングシルガード184
UVランプオリエル 66943 200W水銀灯オリエ
熱風炉ウルトラ·インスツルメンツカスタムメード 50℃に設定
ホットプレート IKA社のラボ用機器 3810000 http://www.ika.com
プラズマクリーナー Harrickプラズマ PDC-32G
スピナー半導体製造装置 SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
ガラスカバースリップゴールドシール 22 X 22ミリメートル、厚さ1号
線虫C. elegans 線虫の遺伝学センター（CGC） e1265、ayIs4
ショウジョウバエ ブルーミントン P {chaGAL4} / CYO、UAS-syt.eGFP
ゼブラフィッシュインドの野生型野生型
タイゴンチューブシグマ Z279803
マイクロニードルシグマ Z118044 1cmの片に切断
3方活栓シグマ S7521
ハリスパンチャーシグマ Z708631
圧縮窒素ガス地元のガスサプライヤー圧力を制御するレギュレータを使用して、
ステレオ顕微鏡 ニコン SMZ645
共焦点顕微鏡アンドール＆オリンパス横河電機回転するディスク共焦点顕微鏡
ImageJの国立衛生研究所 www.rsbweb.nih.gov / IJ Javaベースの画像処理プログラム

参考文献

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