Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Riepilogo

Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico libera In vivo Imaging C. elegans, Intatto Drosophila Larve e larve di zebrafish. Il dispositivo utilizza una membrana deformabile PDMS per immobilizzare questi organismi modello per eseguire lapse imaging tempo di numerosi processi come il battito cardiaco, la divisione cellulare e subcellulare trasporto neuronale. Abbiamo illustrato l'utilizzo di questo dispositivo e mostrano esempi di diversi tipi di dati raccolti da diversi sistemi modello.

Abstract

Micro dispositivi fabbricati fluidici fornire un micro-ambiente accessibile per gli studi in vivo su piccoli organismi. Processi di fabbricazione semplici sono disponibili per i dispositivi microfluidici che utilizzano tecniche di litografia morbidi ^1-3. Dispositivi microfluidici sono stati utilizzati per la sub-cellulare di imaging ^4,5, in vivo laser microchirurgia ^2,6 e ^4,7 di imaging cellulare. In vivo imaging richiede immobilizzazione di microrganismi. Questo è stato ottenuto utilizzando aspirazione ^{5,8, 6,7,9} canali conici, membrane deformabili ^2-4,10, aspirazione con raffreddamento supplementare ^5, gas anestetico ^11, gel sensibili alla temperatura ^{12, 13} e colla cianoacrilato anestetici come levamisole ^{14 , 15.} Anestetici comunemente usati influenzare la trasmissione sinaptica ^16,17 e sono noti per avere effetti nocivi sulla sub-cellulare ⁴ Trasporti neuronale. In questa study si dimostra una membrana a base di poli-dimetil-silossano (PDMS), dispositivo che permette di immobilizzazione senza anestetico intatte organismi modello genetiche come Caenorhabditis elegans (C. elegans), larve di Drosophila e larve di zebrafish. Questi organismi modello sono adatti per gli studi in vivo in dispositivi microfluidici causa dei loro diametri piccoli e organismi otticamente trasparenti o traslucide. Diametri del corpo vanno da ~ 10 micron a ~ 800 micron per i primi stadi larvali di C. elegans e zebrafish larve e richiedono dispositivi microfluidici di diverse dimensioni per ottenere l 'immobilizzazione completa ad alta risoluzione time-lapse imaging. Questi organismi sono immobilizzati mediante pressione esercitata dal gas azoto compresso attraverso una colonna di liquido e ripreso utilizzando un microscopio invertito. Animali rilasciati dalla trappola tornare alla normale locomozione entro 10 min.

Dimostriamo quattro applicazioni di time-lapse imaging in C. elegansvale a dire, il trasporto di imaging mitocondriale nei neuroni, pre-sinaptico di trasporto delle vescicole in un trasporto difettoso-mutante, il trasporto recettori del glutammato e la divisione neuroblasti Q cellulare. I dati ottenuti da questi film mostrano che l'immobilizzazione microfluidica è un mezzo utile e preciso di acquisire dati in vivo di eventi cellulari e sub-cellulari rispetto agli animali anestetizzati (Figura 1J e 3C-F ^4).

Dimensioni del dispositivo sono state modificate per consentire time-lapse imaging di diverse fasi di C. elegans, Drosophila primo stadio le larve e larve di zebrafish. Trasporto di vescicole contrassegnati con synaptotagmin contrassegnati con GFP (syt.eGFP) nei neuroni sensoriali mostra movimento diretto di marcatori delle vescicole sinaptiche espressi nei neuroni colinergici sensoriali intatte prima larve instar Drosophila. Un dispositivo simile è stato utilizzato per effettuare time-lapse imaging del battito cardiaco in ~ 30 ore dopo la fecondazione (HPF)Zebrafish larve. Questi dati mostrano che i dispositivi semplici che abbiamo sviluppato può essere applicato ad una varietà di sistemi modello per lo studio di fenomeni biologici diversi cellulari e di sviluppo in vivo.

Protocollo

1. SU8 Maestro Fabrication

1. Progettare le strutture microfluidica utilizzando software Clewin e stamparlo con 65.024 plotter DPI laser con dimensione minima di 8 micron su pellicola circuito.
2. Pulire 2 cm x 2 centimetri wafer di silicio con ossido nativo in KOH al 20% per 1 min e risciacquo in acqua deionizzata; wafer uno strato per ogni flusso e il suo livello di controllo corrispondente.
3. Asciugare i pezzi con gas azoto e disidratare su una piastra calda a 120 ° C per 4 h. Permettono i pezzi raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva.
4. Luogo pezzi di silicio, uno alla volta sul mandrino filatore e accendere il vuoto. Coprire le superfici di silicio con ~ 20 microlitri esametil-disilazane (HMDS) e spalmare con un SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 3.000 rpm per 30 sec.
5. Coprire completamente con wafer di silicio ~ 1.5 ml di SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) e wafer manto con SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 2.000 rpm per 30 sec. Questo protocollo filatura produce uno spessore di fotoresist ~ 40 pm che è adatto per il controllo di flusso e di strati per primi stadi larvali di C. elegans.
6. Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 utilizzando SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 2.000 rpm per 30 secondi per ottenere uno spessore di fotoresist ~ 80 um che è adatto per la fabbricazione di flusso strato di ritardo stadi larvali di C. elegans, strato basale di flusso per Drosophila / zebrafish larve e le loro livelli di controllo corrispondenti.
7. Mettere i pezzi di silicio sulla piastra calda con lo strato SU8 rivestimento sulla parte superiore. Morbido cuocere i pezzi rivestito in silicone a 65 ° C per 1 min seguito da 95 ° C per 10 min. Permettono i pezzi raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva.
8. Posizionare i soft-cotti pezzi di silicio sul palco esposizione con SU8-2025 rivestito sursulla faccia superiore rivolta verso la lampada UV. Utilizzare la maschera foto con disegno I (L1, Figura 1B) e design II (L2, Figura 1B) per il livello del flusso e lo strato di pattern di controllo rispettivamente per i primi stadi larvali di C. elegans. Posizionare la maschera fotografica sopra dello strato SU8 e garantire la maschera è piatta contro lo strato di rivestimento. Aprire lo sportello della lampada UV ed esporre i soft-forno SU8 wafer a 200 Watt lampada UV attraverso la maschera foto per 15 sec.
9. Utilizzare la maschera di foto con disegno I (L1, Figura 1B) e design II (L2, Figura 1B) su SU8-2050 pezzi rivestiti (preparato secondo il punto 1.6) per produrre il livello di flusso e livello di controllo per fine stadi larvali di C. elegans. Utilizzare la maschera foto con il disegno I (L1, Figura 1C) e design II (L2, Figura 1C) per il livello di flusso basale e strato di controllo rispettivamente per Drosophila / zebrafish larve su wafer rivestiti con SU8-2050 (preparato in punto 1.6). Esporre le SU8 superfici attraverso la maschera foto per la lampada UV 200 Watt per 15 sec.
10. Posizionare i pezzi di silicio esposti su una piastra calda con lo strato di rivestimento sulla parte superiore. Lasciare cuocere i wafer a 65 ° C per 1 min seguita da 95 ° C per 10 min. Permettono i pezzi raffreddare prima di procedere alla fase successiva.
11. Sviluppare i pezzi con il SU8 soluzione di sviluppo per 20 min. Sciacquare i pezzi in Alcole isopropilico (IPA) ed asciugare con gas azoto.
12. Posizionare i pezzi di silicio in un essiccatore con il modello SU8 sopra. Rivestire i pezzi con 50 pl di tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano vapore in un essiccatore per 2 h.

Precauzioni: Prendere misure di sicurezza per la manipolazione dei prodotti chimici durante il trattamento con KOH, rivestimento photoresist e lo sviluppo. Silano rivestimento vapore deve essere eseguita all'interno di un essiccatore in una zona ventilata. Proteggere SU8 resistere da eccessiva esposizione alla luce. Usare occhiali di protezione con un lig UVht sorgente.

2. PDMS Mold Fabrication

1. Preparare 10:01 PDMS combinando 50 g di Sylgard 184 base con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto manualmente per ~ 3 min. Degassare la miscela all'interno di un essiccatore per rimuovere tutte le bolle d'aria formatesi durante la miscelazione.
2. Versare da 5 mm di spessore miscela PDMS nei wafer di silicio con SU8 modello di progettazione II, per il livello di controllo, delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria. In caso di formazione durante versando, degassare il PDMS sul modello SU8 in basso vuoto per rimuovere tutte le bolle.
3. Mettere le fette di silicio con SU8-2025 modello di design che, per il livello di flusso, il mandrino filatore e accendere il vuoto per tenerli. Coprire le cialde con ~ 1 ml di miscela PDMS e coprire le wafer mediante SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 1.500 rpm per 30 sec.
4. Coat ~ 1 ml mix PDMS su wafer di silicio con 80 micron SU8-2050 modello di progettazione I (L1, Figura 1B), per lastrato di flusso per fine stadi larvali di C. elegans utilizzando la SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 1.000 rpm per 30 sec. Coat uno spesso strato di miscela PDMS sui pezzi in silicone con SU8-2050 modello di progettazione I flussi strato (L1, Figura 1C) per Drosophila / zebrafish larve, utilizzando SPIN150 filatore a 500 rpm per 35 sec.
5. Cuocere i pezzi di silicio PDMS rivestite di progettazione I e II wafer con il disegno corrispondente per il controllo del livello contenente PDMS per C. larve elegans e / o Drosophila / zebrafish in un forno a convezione di aria calda a 50 ° C per 6 ore.
6. Tagliare il pezzo PDMS dal substrato di silicio contenente il modello SU8 II C. elegans e / o Drosophila / zebrafish larve con una lama affilata. Effettuare un piccolo foro di circa 1 mm di diametro sulla parte superiore del serbatoio collega la trappola principale nello stampo PDMS utilizzando un perforatore Harris.
7. Posizionare il pugno PDMS blocco (che contiene lo stampo 40 micron di spessore per il controllostrato L2) su un vassoio di plastica, con il lato stampato dello strato di controllo verso l'alto. Posizionare il wafer di silicio rivestito PDMS contenente i 40 micron di spessore SU8 che disegno sul vassoio stesso, con la superficie PDMS rivestita rivolta verso l'alto. Inserire il vassoio all'interno della camera di plasma detergente e attivare il vuoto per 2 min. Successivamente, accendere il plasma e abbassare la pressione della camera finché la camera diventa di colore rosa chiaro. Esporre entrambe le superfici a 18 Watt aria plasma sotto vuoto basso per 2 min.
8. Posizionare il blocco di un pugno PDMS rimosso dai 80 micron di spessore SU8 master contenente modello II per la fine di stadi larvali di C. larve elegans o Drosophila / zebrafish su un vassoio di plastica, con il lato stampato dello strato di controllo verso l'alto. Posizionare la corrispondente rotazione cotto strato rivestito PDMS sul wafer di silicio contenente 80 micron di spessore motivo ho per dopo C. stadi elegans o Drosophila / zebrafish larve contemporaneamente sullo stesso vassoio con la s rivestito piatto PDMSurface rivolto verso l'alto. Utilizzare lo stesso protocollo di cui sopra per esporli al plasma ad aria.
9. Posizionare le due superfici trattate al plasma per C. elegans e / o Drosophila / zebrafish larve con leggera pressione e cuocere in forno a convezione di aria calda a 50 ° C per 2 h.
10. Tagliare i dispositivi legati dal substrato di silicio con disegno che SU8 per C. elegans e / o Drosophila / zebrafish larve. Fori di accesso punzone i serbatoi di ingresso e uscita del canale di flusso.
11. Mettere lo stampo PDMS incollata su un vassoio di plastica per C. elegans, con il lato stampato del disegno strato flusso rivolto verso l'alto. Clean fodera in vetro (22 X 22 mm, n ° 1 spessore) e posizionarlo sul vassoio di plastica stessa. Inserire il vassoio contenente stampo PDMS e fodera in vetro all'interno della camera di plasma. Esporre la superficie inferiore del dispositivo PDMS e fodera di vetro a 18 Watt plasma di aria a bassa pressione per 2 min. Posizionare le due superfici trattate con plasma genpressione tle e cuocere in forno caldo a convezione d'aria a 50 ° C per 2 ore.
12. Conservare il dispositivo in un ambiente pulito per uso futuro.

3. Operazioni aggiuntive per la Drosophila / Zebrafish dispositivo

1. Esporre superficie pulita di vetro di dimensioni 2 cm x 2 cm con 50 pl di tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano vapore in un essiccatore per 2 h.
2. Spin ~ 1 ml di miscela 10:01 PDMS preparato nella fase 2,1 sulla superficie di vetro silanizzato con SPIN150 filatore a 500 rpm per 35 sec. Cuocere i substrati di vetro rivestite PDMS in un forno ad aria calda a 50 ° C per 6 ore con la superficie rivestita rivolta verso l'alto. Permettere lo strato PDMS raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva.
3. Punzone dello strato rivestito con un perforatore personalizzato costruito in metallo affilato al centro del PDMS, per formare lo strato distanziatore PDMS. La forma del metallo perforatore è progettato simile al disegno di flusso per Drosophila / zebrafish (L1, Figura 1C ).
4. Esporre il strato distanziatore PDMS e il singolo-bonded blocco (livello di flusso e livello di controllo, fatta allo step 2.9 per Drosophila / zebrafish larve) a 18 Watt al plasma ad aria con filtro plasma a basso vuoto. Posizionare le due superfici trattate insieme plasma e cuocere in forno ad aria calda a 50 ° C per 2 h.
5. Tagliare il dispositivo accoppiato dal vetro, fori di accesso punzone i serbatoi di ingresso e uscita e il legame ad un vetrino di vetro (22 X 22 mm, spessore No. 1) usando un detergente plasma come indicato nel passo 2,11. Ciò produrrebbe un dispositivo di immobilizzazione per primo larve instar Drosophila con altezza canale di ~ 500 micron. Per le larve di zebrafish, duplicare il processo distanziatore PDMS strato di fabbricazione con un passo ulteriore legame. Il doppio strato di PDMS-S produce una altezza canale di 900 micron per 30 larve HFP zebrafish.

Precauzioni: Evitare di particelle di polvere durante la fabbricazione del dispositivo. Due plasma pulito superficies devono essere completamente priva di polvere per l'incollaggio corretto. Memorizzare i dispositivi in ​​un essiccatore in situazioni in cui una camera pulita speciale non è disponibile per minimizzare l'accumulo di particelle di polvere in dispositivi.

4. Utilizzo di membrana PDMS

1. Collegare un'estremità di un micro-flex tubo (diametro interno ~ 1,6 mm, diametro esterno ~ 4,8 mm) ad una pressione regolatore di alimentazione di gas azoto e l'altra estremità al serbatoio principale trappola attraverso un ago 18 gauge (diametro esterno ~ 1,25 mm) incollati al tubo. Un rubinetto a 3 vie utilizzato al centro del tubo di collegamento consente l'applicazione o il rilascio della pressione sulla membrana.
2. Riempire il tubo collegato al dispositivo PDMS con una colonna da 10 cm di acqua distillata prima di collegarlo al serbatoio della trappola principale di un C. elegans e / o Drosophila / zebrafish dispositivo di larve.
3. Ruotare la valvola di alimentazione dell'azoto per leggere 14 psi e controllare la membrana della trappola principale deviando verso the canale di flusso a basso ingrandimento di un microscopio invertito. Lunghezza della colonna d'acqua nel micro-flex tubo viene compressa quando il rubinetto a 3 vie è aperta. Bordi della membrana deflesso sono visibili in luce trasmessa (Figura 1I e 1J). Deflessione della membrana provoca lo spostamento delle particelle di polvere / bolle sotto la membrana PDMS e li spinge ai confini di canale.
4. Attendere che il liquido riempie il frontale microcanali completamente senza l'aria intrappolata.
5. Rilasciare la pressione mediante il rubinetto a 3 vie per rilassare la membrana nella posizione di riposo.

5. Inserimento di C. Le larve elegans, Drosophila e Zebrafish nel dispositivo e Immobilizzare sotto la membrana flessibile PDMS

1. Riempire il canale di flusso con M9 buffer [3 g KH ₂ PO _4, 6 g di Na ₂ HPO _4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO _4, H ₂ O a 1 L, sterilizzare in autoclaving] per C. elegans 18 o 1X PBS [8 g di NaCl, KCl 0,2 g, 1,44 g di Na ₂ HPO _4, 0,24 g di KH ₂ PO _4, H ₂ O a 1 L, sterilizzare in autoclave] per Drosophila / zebrafish 19 larve per 10 minuti prima di esperimento.
2. Individuare un unico C. elegans di fase richiesto su un piatto NGM ¹⁸ (o primo stadio le larve di Drosophila da piastra di agar uovo o manualmente dechorionated 30 larve di zebrafish hpf in mezzo liquido ²⁰⁾ con un basso stereo microscopio ingrandimento. Scegliere un singolo animale con un piccolo volume di soluzione tampone in una punta micro. Utilizzare una punta micro con la sua estremità tagliate per ospitare grandi la Drosophila o larve zebrafish in tampone.
3. Spingere il singolo organismo attraverso l'ingresso canale di flusso. Regolare la pressione di pipettaggio per posizionare il singolo animale sotto la trappola principale.
4. Aumentare la pressione della membrana PDMS lentamente per posizionare l'animale contro la chanNel confine e immobilizzarlo con 14 psi di pressione per C. elegans, 7 psi per Drosophila e 3 psi per le larve di zebrafish.
5. Posizionare l'animale immobilizzato al centro del campo di vista microscopico. Utilizzare un microscopio invertito con le impostazioni desiderate per il settore alta risoluzione luminoso o imaging di fluorescenza. Acquisizione di immagini singole o fluorescenza time-lapse a frame rate predefinito.
6. Rilasciare la pressione trappola e monitorare la locomozione dell'animale per 5-10 min a basso ingrandimento.
7. Lavare l'animale e inserire un animale fresco per ripetere i passaggi precedenti.
8. Lavare tutti gli animali dalla riserva dei rifiuti con acqua distillata applicato con una siringa. Asciugare il canale premendo aria utilizzando una siringa per il riutilizzo futuro.

Precauzioni: Animali che richiedono la pressione pipettaggio superiore al flusso all'interno del canale principale tendono a mostrare scarsa locomozione / salute dopo l'uscita dalla trappola e dovrebbe essere evitato per imaging. Pulire il canale di flusso per ogni traccia di tampone per evitare l'intasamento del canale da cristalli. Se viene utilizzato olio per immagini ad alta risoluzione, pulire il vetrino di vetro per poter mantenere buon rapporto segnale rumore per successivi esperimenti.

Risultati

Il dispositivo di immobilizzazione è un blocco bistrato PDMS fabbricato legando due strati: uno strato di flusso (Layer 1) e uno strato di controllo (Layer 2) come mostrato in Figura 1. La trappola principale è collegato ad una bombola di gas azoto attraverso un regolatore ed un rubinetto di arresto a 3 vie per applicare necessaria (3-14 psi) di pressione sulla membrana attraverso una colonna di liquido (Figura 1A). La membrana deviato immobilizza C. larve elegans, Drosop...

Discussione

PDMS dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, pertanto può essere utilizzata per alta risoluzione immagini in vivo di qualsiasi trasparente / traslucido organismo modello. Il nostro design è adatto per l'alta ingrandimento spazio-temporale di immagini di eventi cellulari e sub-cellulari in intatti animali vivi. Microfabrication con tecniche di litografia soft permette una facile manipolazione delle dimensioni del dispositivo disponibili per varie dimensioni di organismi modello. Dispositivi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Wafer di silicio	Università di wafer	150 mm (100) Mech Grado SSP Si
Clewin Software	WieWeb software	Versione 2.90
Plotter laser	Linea Imaging fine	65024 DPI
HMDS	Sigma-Aldrich	440191-100ML
SU8	Microchem	SU8-2025, SU8-2050
Sviluppatore	Microchem	SU8 Developer
Silano	Sigma-Aldrich	448931-10G
PDMS	Dow corning	Sylgard 184
Lampada UV	Finestra sporgente	66943	200W Hg Oriel Luce
Stufa ad aria calda	Strumenti Ultra	Una soluzione su misura	A 50 ° C
Placca di cottura	IKA Apparecchiature di laboratorio	3810000	http://www.ika.com
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Spinner	Semiconduttore e Sistemi di Produzione	SPIN150-NPP	www.sps-Europe.com
Vetro fodera	Gold Seal	22 X 22 mm, spessore No. 1
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	e1265, ayIs4
Drosophila	Bloomington	P {} chaGAL4 / cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish	Indiano wild type	Tipo selvatico
Tygon Tubo	Sigma	Z279803
Micro ago	Sigma	Z118044	Tagliare a pezzi di cm 1
Rubinetto a 3 vie	Sigma	S7521
Harris puncher	Sigma	Z708631
Gas azoto compresso	Gas locale		Utilizzare un regolatore per il controllo della pressione
Microscopio Stereo	Nikon	SMZ645
Microscopio confocale	Andor & Olympus	Yokogawa filatura disco microscopio confocale
ImageJ	National Institutes of Health	www.rsbweb.nih.gov / IJ	Basato su Java programma di elaborazione delle immagini