Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Résumé

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit In vivo Imagerie de C. elegans, Intact Drosophila Larves et des larves de poisson zèbre. Le dispositif utilise une membrane déformable PDMS pour immobiliser ces organismes modèles pour effectuer une imagerie laps de temps de nombreux procédés tels que battement de coeur, la division cellulaire et subcellulaire de transport neuronale. Nous démontrons l'utilisation de cet appareil et de montrer des exemples de différents types de données collectées à partir des systèmes de modèles différents.

Résumé

Micro fabriqués dispositifs fluidiques fournir un accès micro-environnement pour les études in vivo sur de petits organismes. Procédés de fabrication simples sont disponibles pour dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie douce ^1-3. Dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour les sous-imagerie cellulaire ^4,5, in vivo microchirurgie au laser et imagerie cellulaires ^{2,6 4,7.} L'imagerie in vivo nécessite l'immobilisation des organismes. Ceci a été réalisé en utilisant une aspiration ^{5,8, 6,7,9} canaux coniques, des membranes déformables, ^2-4,10 aspiration avec refroidissement supplémentaire ^5, gaz anesthésique ^11, gels sensibles à la température ^{12, 13} et colle cyanoacrylate anesthésiques tels que le lévamisole ^{14 , 15.} Anesthésiques couramment utilisés influencer la transmission synaptique ^16,17 et sont connus pour avoir des effets néfastes sur la sous-cellulaire ⁴ transport neuronal. Dans cette èreudy nous démontrons une membrane à base de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) dispositif qui permet l'immobilisation sans anesthésie intactes organismes modèles génétiques telles que Caenorhabditis elegans (C. elegans), larves de drosophile et les larves de poisson zèbre. Ces organismes modèles sont adaptés pour des études in vivo dans des dispositifs microfluidiques en raison de leurs faibles diamètres et des organismes optiquement transparents ou translucides. Diamètres de corps vont de ~ 10 um à 800 um ~ pour les premiers stades larvaires de C. larves elegans et le poisson zèbre et nécessitent des dispositifs microfluidiques de tailles différentes pour atteindre une immobilisation complète pour la résolution imagerie time-lapse élevé. Ces organismes sont immobilisés en utilisant la pression appliquée par l'azote gazeux comprimé à travers une colonne de liquide et imagée à l'aide d'un microscope inversé. Animaux libérés du piège de revenir à la locomotion normale dans les 10 min.

Nous démontrons quatre applications imagerie time-lapse en C. elegansnommément imagerie mitochondriale de transport dans les neurones, le transport vésiculaire présynaptique dans un transport défectueux mutant, le transport des récepteurs du glutamate et de la division cellulaire Q neuroblastes. Les données obtenues à partir de ces films montrent que l'immobilisation microfluidique est un moyen utile et précise de l'acquisition de données in vivo d'événements cellulaires et sub-cellulaires par rapport aux animaux anesthésiés (figure 1J et 3C-F ^4).

Dimensions de l'appareil ont été modifiées pour permettre imagerie time-lapse de différents stades de C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre. Transport de vésicules marquées par synaptotagmine marqués à la GFP (syt.eGFP) dans les neurones sensoriels montre mouvement dirigé des marqueurs de vésicules synaptiques cholinergiques exprimés dans les neurones sensoriels de larves de premier stade intacte chez la drosophile. Un dispositif similaire a été utilisée pour effectuer imagerie time-lapse de battement de coeur dans ~ 30 heures après la fécondation (HPF)poisson-zèbre larves. Ces données montrent que les dispositifs simples que nous avons développées peuvent être appliquées à une variété de systèmes modèles pour étudier les phénomènes cellulaires plusieurs biologiques et de développement in vivo.

Protocole

1. SU8 Fabrication Maître

1. Concevoir les structures microfluidiques utilisant le logiciel Clewin et l'imprimer en utilisant 65.024 traceur laser DPI avec taille minimum de 8 um sur le film du circuit imprimé.
2. Nettoyer 2 cm X 2 cm de plaquettes de silicium avec oxyde natif dans 20% KOH pour 1 min et rincer à l'eau déminéralisée; une plaquette pour chaque couche de l'écoulement et sa couche de contrôle correspondant.
3. Sécher les pièces avec de l'azote gazeux et déshydrater sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 4 heures. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l'étape suivante.
4. Morceaux de silicium lieu une à la fois sur le métier à filer et tourner mandrin sur le vide. Couvrir les surfaces de silicium avec ~ 20 pl hexaméthyldisilazane (HMDS) et les enrober à l'aide d'un. SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 3.000 tours par minute pendant 30 sec
5. Couvrir des tranches de silicium complètement avec ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) et des plaquettes en utilisant le manteau SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 sec. Ce protocole de filage produit une épaisseur de photoréserve ~ 40 um qui est approprié pour la commande d'écoulement et les couches pour les premiers stades larvaires de C. elegans.
6. ~ 1,5 ml de spin SU8-2050 en utilisant SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 secondes pour obtenir une épaisseur de résine photosensible ~ 80 um qui est adapté à la fabrication de la couche d'écoulement de fin stades larvaires de C. elegans, la couche basale de débit pour Drosophila / poisson zèbre larves et leurs niveaux de contrôle correspondants.
7. Placez les morceaux de silicium sur plaque chauffante avec la couche SU8 couché sur le dessus. Souple cuire les morceaux de silicium recouvertes à 65 ° C pendant 1 min, puis 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l'étape suivante.
8. Placez les morceaux de silicium soft-cuits sur la scène d'exposition avec SU8-2025 sur enduitface sur la face supérieure de la lampe UV. Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) pour la couche d'écoulement et motif de couche de contrôle respectivement pour les premiers stades larvaires de C. elegans. Placer le masque photo sur le dessus de la couche de SU8 et assurer le masque est à plat contre la couche de revêtement. Ouvrez le volet de la lampe UV et d'exposer les SU8 soft-cuits plaquettes à 200 Watt Lampe UV à travers le masque photo pendant 15 sec.
9. Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) sur SU8-2050 pièces revêtues (préparé à l'étape 1.6) pour la fabrication de la couche d'écoulement et de la couche de contrôle pour fin stades larvaires de C. elegans. Utiliser le masque photo avec le motif (L1, figure 1C) I et II de conception (L2, figure 1C) pour le débit de la couche basale et la couche de contrôle respectivement pour la drosophile / poisson zèbre larves sur des plaquettes revêtues de SU8-2050 (i préparéEtape n 1,6). Exposer les surfaces SU8 à travers le masque photo pour la lampe UV de 200 watts pendant 15 secondes.
10. Placer les morceaux de silicium exposées sur une plaque chauffante avec la couche enduite sur le dessus. Déposer cuire les tranches à 65 ° C pendant 1 min suivie de 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir avant de procéder à l'étape suivante.
11. Développer les pièces en utilisant la solution SU8 développeur pendant 20 min. Rincer les morceaux dans de l'alcool isopropylique (IPA) et sécher à l'aide de l'azote gazeux.
12. Placer les morceaux de silicium dans un dessicateur avec le motif sur le dessus SU8. Enduire les morceaux avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures.

Précautions: Prendre les précautions pour manipulation des produits chimiques au cours du traitement KOH, revêtement de résine photosensible et en développement. Silane revêtement en phase vapeur doit être effectué à l'intérieur d'un dessiccateur dans un endroit aéré. Protéger résine SU8 de plus de l'exposition à la lumière. Utilisez des lunettes de protection UV avec une ligsource de ht.

2. Fabrication de moules PDMS

1. Préparer 10:01 PDMS en combinant 50 g de Sylgard 184 de base avec 5 g de durcisseur dans un gobelet en plastique. Mélanger manuellement le contenu de ~ 3 min. Dégazer le mélange à l'intérieur d'un dessiccateur pour éliminer toutes les bulles d'air formées pendant le mélange.
2. Versez un mélange de 5 mm d'épaisseur PDMS sur les plaquettes de silicium avec SU8 modèle de conception II, pour la couche de contrôle, doucement pour éviter la formation de bulles d'air. Dans le cas où des bulles se forment lors de la coulée, dégazer le PDMS sur le modèle SU8 dans le vide bas pour enlever toutes les bulles.
3. Placer les tranches de silicium avec SU8-2025 modèle de conception que j'ai, pour la couche d'écoulement, sur le mandrin spinner et allumez le vide pour les retenir. Couvrir les plaquettes avec ~ 1 ml de mélange PDMS et enrober les pastilles à l'aide SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.500 tours par minute pendant 30 sec.
4. ~ 1 ml manteau PDMS mélange sur des tranches de silicium avec l'um 80 SU8-2050 modèle de conception I (L1, figure 1B), pour lacouche d'écoulement pour fin stades larvaires de C. elegans en utilisant la centrifugeuse SPIN150 à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.000 tours par minute pendant 30 sec. Enduire une couche épaisse de mélange PDMS sur les morceaux de silicium avec SU8-2050 modèle de flux de couche de dessin I (L1, figure 1C) pour Drosophila / poisson-zèbre, en utilisant des larves SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 35 sec.
5. Cuire des morceaux de PDMS avec revêtement en silicone de conception I et plaquettes avec un design correspondant II pour le contrôle de la couche contenant PDMS pour C. larves elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre dans un four à convection d'air chaud à 50 ° C pendant 6 heures.
6. Découper la pièce à partir de PDMS contenant le substrat de silicium du motif de SU8 C. II elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves à l'aide d'une lame tranchante. Percer un trou de petit diamètre de ~ 1 mm au-dessus du réservoir principal reliant le piège dans le moule PDMS en utilisant un perforateur Harris.
7. Placez le poing PDMS bloc (contenant le moule 40 um d'épaisseur pour le contrôlecouche L2) sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez la tranche de silicium revêtue PDMS contenant des 40 um d'épaisseur SU8 conception que j'ai sur le même plateau, avec le PDMS surface enduite orientée vers le haut. Insérez le bac dans la chambre de nettoyeur à plasma et mettez le vide pendant 2 min. Par la suite, la mise sous tension du plasma et abaisser la pression dans la chambre jusqu'à ce que la chambre vire au rose pâle. Exposer les deux surfaces à 18 Watt air par plasma sous vide basse pendant 2 min.
8. Placez le bloc de poing PDMS retiré les 80 um d'épaisseur SU8 maître modèle contenant II pour la fin stades larvaires de C. elegans ou larves de Drosophila / poisson zèbre sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez le correspondant de spin cuite couche de PDMS déposé sur la plaquette de silicium contenant 80 um d'épaisseur conception I pour plus tard C. étapes elegans ou la drosophile / poisson zèbre larves simultanément sur ​​le même plateau avec le plat recouvert PDMS surface vers le haut. Utiliser le même protocole mentionné ci-dessus pour les exposer à l'air plasma.
9. Placez les deux surfaces de plasma traités pour C. elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves avec une légère pression et faites cuire au four les convection d'air chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
10. Découper les dispositifs asservis du substrat de silicium avec SU8 conception de C. I elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves. Perforation des trous d'accès à des réservoirs d'entrée et de sortie du canal d'écoulement.
11. Placer le moule PDMS collé sur un plateau en plastique pour C. elegans, avec le côté moulé de la conception de la couche d'écoulement vers le haut. Clean lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) et le placer sur le même plateau en plastique. Insérez le bac contenant moule PDMS et lamelle de verre à l'intérieur de la chambre à plasma. Exposer la surface inférieure du dispositif de PDMS et lamelle de verre de 18 Watt plasma d'air à basse pression pendant 2 min. Placez les deux surfaces de plasma traités avec gentle la pression et faire cuire au four les convection d'air chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
12. Stocker l'appareil dans un environnement propre pour une utilisation future.

3. Étapes supplémentaires pour la drosophile / Zebrafish périphérique

1. Exposer la surface de verre propre de taille 2 cm x 2 cm avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures.
2. Spin ~ 1 ml de 10:1 mélange PDMS préparé à l'étape 2.1, la surface du verre silanisé utilisant SPIN150 spinner à 500 tours par minute pendant 35 sec. Cuire les substrats de verre revêtus PDMS dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 6 heures avec la surface revêtue vers le haut. Permettre à la couche de PDMS refroidir à température ambiante avant de procéder à l'étape suivante.
3. Poinçon la couche de revêtement à l'aide d'un perforateur personnalisé construit en métal pointu au milieu du PDMS, pour former la couche d'espacement PDMS. La forme du poinçon métallique est conçu semblable à la conception de flux de Drosophila / poisson zèbre (L1, figure 1C ).
4. Exposer la couche d'espacement PDMS et l'unique lié bloc (débit de la couche et la couche de contrôle, effectuée à l'étape 2.9 pour Drosophila / poisson zèbre larves) à 18 watts d'air plasma en utilisant nettoyeur à plasma à faible vide. Placez les deux surfaces de plasma traités ensemble et les faire cuire dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
5. Couper le dispositif lié à partir de la vitre, les trous d'accès à poinçonner les réservoirs d'entrée et de sortie et elle liaison à une lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) en utilisant un filtre à plasma tel que mentionné dans l'étape 2,11. Cela permettrait de produire un dispositif d'immobilisation pour les larves de premier stade drosophile avec une hauteur de canal de ~ 500 um. Pour embryons de poisson zèbre, dupliquez le calque entretoise PDMS procédé de fabrication d'une étape de liaison supplémentaire. La double couche de PDMS-S produit une hauteur de canal de 900 um pour 30 hfp poisson zèbre larves.

Précautions: Eviter les particules de poussière lors de la fabrication du dispositif. Deux plasma nettoyé la surfaces doivent être complètement exempte de poussière pour une bonne adhérence. Stocker les appareils dans un dessiccateur dans les situations où une salle spéciale propre n'est pas disponible de manière à minimiser l'accumulation de particules de poussière dans les appareils.

4. Utilisation PDMS Membrane

1. Connecter une extrémité d'un tube de micro-flex (diamètre intérieur ~ 1,6 mm, diamètre extérieur 4,8 mm ~) à un régulateur d'alimentation en azote gazeux sous pression et l'autre extrémité au réservoir principal de collecteur à travers une aiguille de calibre 18 (diamètre extérieur ~ 1,25 mm) collé au tube. Un robinet 3-voies utilisées dans le milieu de la connexion du tube permet l'application ou la libération de la pression sur la membrane.
2. Remplir le tube relié au dispositif de PDMS avec une colonne de 10 cm d'eau distillée avant de le raccorder au réservoir de la trappe principale d'un C. elegans et / ou de larves de drosophile / poisson zèbre.
3. Activer la soupape de la fourniture d'azote à 14 psi lire et contrôler la membrane du piège principal de déviation vers èmee canal d'écoulement à faible grossissement d'un microscope inversé. Longueur de la colonne d'eau dans le tube de micro-flex est comprimé lorsque le robinet à 3 voies est ouverte. Bords de la membrane dévié, sont visibles en lumière transmise (figure 1I et 1J). Déviation membrane provoque un déplacement des particules de poussière / bulles sous la membrane de PDMS et les pousse aux limites du canal.
4. Attendez que le liquide remplit avant le microcanal complètement sans bulles d'air.
5. Relâcher la pression à l'aide du robinet 3-voies pour détendre la membrane à sa position de repos.

5. Insertion C. Les larves elegans, la drosophile et le poisson-zèbre dans l'appareil et les immobiliser sous la membrane flexible PDMS

1. Remplir le canal d'écoulement avec un tampon M9 [3 g KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO _4, H ₂ O à 1 L, stériliser par autoclaving] pour C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, 0,24 g de KH ₂ PO _4, H ₂ O à 1 L, stériliser à l'autoclave] pour Drosophila / 19 pour le poisson-zèbre larves 10 min avant un expérience.
2. Localiser un seul C. elegans de passage obligé sur une plaque NGM ¹⁸ (ou larves de premier stade drosophile de la plaque de gélose oeuf ou manuellement dechorionated 30 larves du poisson zèbre hpf en milieu liquide ²⁰⁾ à l'aide d'un microscope stéréo à faible grossissement. Choisissez un seul animal en utilisant un petit volume de solution tampon dans un embout micro. Utiliser un embout de micro avec son extrémité coupée pour accueillir plus la drosophile ou poisson zèbre dans le tampon.
3. Poussez le seul organisme à travers l'entrée du canal d'écoulement. Régler la pression de pipetage pour positionner l'animal individuel dans le piège principal.
4. Augmenter la pression de la membrane de PDMS lentement à la position de l'animal contre la chanfrontière nel et l'immobiliser avec 14 psi pour C. elegans, 7 psi pour la drosophile et 3 psi pour les larves de poisson zèbre.
5. Positionner l'animal immobilisé au centre du champ de vision microscopique. Utiliser un microscope inversé au niveau désiré pour le champ lumineux haute résolution ou l'imagerie par fluorescence. Acquérir une ou time-lapse images de fluorescence à la cadence prédéfinie.
6. Relâcher la pression piège et contrôler la locomotion de l'animal pendant 5-10 min à faible grossissement.
7. Rincer l'animal et insérer un animal frais de répéter les étapes ci-dessus.
8. Lavez tous les animaux à partir du réservoir de déchets en utilisant de l'eau distillée appliqué à l'aide d'une seringue. Sécher le canal en poussant l'air à l'aide d'une seringue pour une réutilisation ultérieure.

Précautions: Animaux nécessitant une pression élevée de pipetage à l'écoulement à l'intérieur du canal principal tendent à montrer locomotion pauvre / santé après la libération du piège et doivent être évités pour imaGing. Nettoyer le canal d'écoulement pour toute trace de tampon pour éviter le colmatage du canal par les cristaux. Si l'huile est utilisée pour l'imagerie haute résolution, nettoyer la lamelle de verre pour être en mesure de maintenir un bon signal sur bruit pour les expériences ultérieures.

Résultats

Le dispositif d'immobilisation est un bloc bicouche PDMS fabriqué par collage de deux couches: une couche d'écoulement (couche 1) et une couche de commande (couche 2) comme le montre la Figure 1. Le piège principal est connecté à une bouteille de gaz azote à travers un détendeur et une vanne d'arrêt 3-voies nécessaires pour appliquer (3-14 livres par pouce carré) de pression sur la membrane à travers une colonne de liquide (figure 1A). La membrane dévié immobili...

Discussion

Dispositifs microfluidiques en PDMS sont optiquement transparents peuvent donc être utilisés pour une grande résolution imagerie in vivo de tout organisme modèle transparent / translucide. Notre modèle est approprié pour un grossissement spatio-temporelle d'imagerie élevé d'événements cellulaires et sous-cellulaires intactes dans les animaux vivants. En utilisant des techniques de microfabrication de lithographie douce permet une manipulation aisée des dimensions de l'appareil pour les di...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Plaquettes de silicium	Plaquette Université	150 mm (100) Mech année SSP Si
Clewin Software	WieWeb logiciel	Version 2.90
Traceur laser	Imagerie Fine Line	65024 DPI
HMDS	Sigma-Aldrich	440191-100ML
SU8	Microchem	SU8-2025, SU8-2050
Promoteur	Microchem	SU8 développeur
Silane	Sigma-Aldrich	448931-10G
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Lampe UV	Oriel	66943	200W Hg. Oriel Lumière
Four à air chaud	Instruments Ultra	Sur mesure	Fixée à 50 ° C
Plaque de cuisson	Équipement de laboratoire IKA	3810000	http://www.ika.com
Nettoyeur à plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Fileur	Systèmes de production de semi-conducteurs	SPIN150-NPP	www.SPS-Europe.com
Lamelle de verre	Sceau d'or	22 X 22 mm, épaisseur n ° 1
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	E1265, ayIs4
Drosophila	Bloomington	P {} chaGAL4 / cyo, SAMU-syt.eGFP
Le poisson zèbre	Indien de type sauvage	De type sauvage
Tube de Tygon	Sigma	Z279803
Micro-aiguille	Sigma	Z118044	Coupez-les en morceaux de 1 cm
3-way robinet	Sigma	S7521
Puncheur Harris	Sigma	Z708631
L'azote gazeux comprimé	Fournisseur de gaz local		Utiliser un régulateur pour réguler la pression
Microscope stéréoscopique	Nikon	SMZ645
Microscope confocal	Andor et Olympus	Yokogawa rotation du disque microscope confocal
ImageJ	National Institutes of Health	www.rsbweb.nih.gov / ij	Basé sur Java programme de traitement d'image