Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Resumo

Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico livre In vivo Imagiologia de C. elegans, Intacta Drosophila Larvas e larvas de peixe-zebra. O dispositivo utiliza uma membrana deformável PDMS para imobilizar estes organismos modelo, a fim de realizar imagem de lapso de tempo de vários processos, tais como o batimento cardíaco, a divisão celular e subcelular transporte neuronal. Nós demonstramos a utilização deste dispositivo e mostram exemplos de diferentes tipos de dados recolhidos a partir de sistemas de modelos diferentes.

Resumo

Micro fabricados dispositivos fluídicos fornecer um micro-ambiente acessíveis para estudos in vivo sobre os organismos pequenos. Processos de fabricação simples estão disponíveis para dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia suave ^1-3. Dispositivos microfluídicos têm sido utilizados para sub-celular de imagem ^4,5, in vivo microcirurgia laser ^2,6 e imagiologia celular ^4,7. In vivo de imagem requer a imobilização dos organismos. Isto foi conseguido usando sucção ^{5,8, 6,7,9} canais cónicos, membranas deformáveis ^{​​2-4,10,} com arrefecimento adicional de sucção ^5, o gás anestésico ^11, geles sensíveis à temperatura ^{12, 13} e cola de cianoacrilato, tais como anestésicos levamisole ^{14 de 15.} Anestésicos comumente utilizados influenciar a transmissão sináptica ^16,17 e são conhecidos por terem efeitos prejudiciais sobre a sub-celular de transporte ⁴ neuronal. Neste stUdy demonstramos uma membrana de base de poli-dimetil-siloxano dispositivo (PDMS) que permite a imobilização sem anestésico intactos organismos modelo genéticas tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila e larvas de larvas de peixe zebra. Estes organismos modelo são adequados para estudos in vivo em dispositivos microfluídicos devido às suas diâmetros pequenos e corpos opticamente transparentes ou translúcidas. Diâmetros de corpo variar de 10 a ~ uM ~ 800 uM para os primeiros estádios larvais de C. elegans e larvas do peixe-zebra e exigir dispositivos microfluídicos de tamanhos diferentes para atingir a imobilização completa de alta resolução de imagem time-lapse. Estes organismos são imobilizadas através de pressão aplicada por comprimido de gás de azoto através de uma coluna de líquido e visualizados utilizando um microscópio invertido. Animais libertados da armadilha retornar para locomoção normais dentro de 10 min.

Demonstramos quatro aplicações de lapso de tempo de imagem em C. elegansou seja, a imagem de transporte mitocondrial nos neurônios, pré-sináptica transporte vesicular em um transporte defeituoso mutante transporte receptor, glutamato e divisão celular Q neuroblastos. Os dados obtidos a partir de tais filmes mostram que a imobilização de microfluidos é um meio útil e precisa de adquirir dados in vivo de eventos celulares e subcelulares em comparação com animais anestesiados (Figura 1J e 3C ^F-4).

Dimensões do dispositivo foram alteradas para permitir lapso de tempo imagens de diferentes fases da C. elegans, primeiro larvas Drosophila e larvas de peixe-zebra. Transporte de vesículas marcadas com sinaptotagmina marcados com GFP (syt.eGFP) em neurônios sensoriais mostra movimento dirigido de marcadores das vesículas sinápticas expressos em colinérgicos neurônios sensoriais intactas em primeira larvas Drosophila estádio. Um dispositivo semelhante tem sido utilizada para a realização de lapso de tempo de imagem de pulsação em ~ 30 h pós-fertilização (hpf)Zebrafish larvas. Estes dados mostram que os dispositivos simples que desenvolvemos pode ser aplicada a uma variedade de sistemas modelo para estudar os fenómenos biológicos diversos celulares e de desenvolvimento in vivo.

Protocolo

1. SU8 Fabricação Mestre

1. Projetar as estruturas microfluídicos usando software Clewin e imprimi-lo usando 65.024 plotter laser de DPI com dimensão mínima de 8 m em circuito filme bordo.
2. Limpar 2 cm x 2 cm com pastilhas de silício óxido nativo em KOH 20%, durante 1 minuto e enxaguar em água desionizada, um wafer de cada camada para o fluxo e a sua camada de controlo correspondente.
3. Seque as peças com gás de azoto e desidratação em uma placa quente a 120 ° C durante 4 horas. Permitir que as peças de arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar para a próxima etapa.
4. Coloque pedaços de silício, um de cada vez no mandril giratório e ligue o vácuo. Cobrir as superfícies de silício com 20 ul ~ hexametil-dissilazano (HMDS) e revesti-los utilizando um. SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 3.000 rpm durante 30 seg
5. Cubra completamente com wafers de silício de 1,5 mL de SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) e pastilhas de revestimento utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 2,000 rpm durante 30 segundos. Este protocolo de fiação produz uma espessura de ~ fotorresistência 40 um que seja adequado para o controlo e as camadas de escoamento para os primeiros estádios larvais de C. elegans.
6. Spin-~ 1,5 ml SU8-2050 usando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 2,000 rpm durante 30 segundos para obter uma espessura de ~ photoresist uM 80 que é adequado para a fabricação da camada de fluxo para tardios estágios larvais de C. elegans, a camada de fluxo basal de Drosophila / zebrafish larvas e suas camadas de controle correspondente.
7. Coloque os pedaços de silício na chapa quente com a camada SU8 revestido em cima. Cozer os pedaços de silício macio revestido a 65 ° C durante 1 min seguido de 95 ° C durante 10 min. Permitir que as peças de arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar para a próxima etapa.
8. Coloque os pedaços de soft-cozidos de silício no palco de exposição com SU8-2025 sur revestidoface na parte superior voltada para a lâmpada UV. Use a máscara de foto com design I (L1, Figura 1B) e II design (L2, Figura 1B) para a camada de fluxo e padrão de camada de controle, respectivamente, para os primeiros estágios larvais de C. elegans. Coloque a máscara foto no topo da camada de SU8 e assegurar a máscara é plana contra a camada de revestimento. Abra o obturador da lâmpada UV e expor os soft-cozidos SU8 wafers de 200 Watt lâmpada UV através da máscara de fotos para 15 seg.
9. Utilize a máscara fotográfica com desenho I (L1, Figura 1B) e II da concepção (L2, Figura 1B) em SU8-2050 pedaços revestidos (preparado no passo 1.6) para fabricar a camada de fluxo de controle e camada final para as fases larvares de C. elegans. Utilize a máscara foto com o desenho I (L1, Figura 1C), e II da concepção (L2, Figura 1C), para a camada de fluxo de base e da camada de controlo, respectivamente, para Drosophila / zebrafish larvas em pastilhas revestidas com SU8-2050 (preparado in passo 1.6). Expor as superfícies SU8 através da máscara foto à lâmpada UV 200 Watt durante 15 segundos.
10. Colocar as peças de silício exposto sobre uma placa quente com a camada de revestimento na parte superior. Mensagem cozer as bolachas a 65 ° C durante 1 min seguido de 95 ° C durante 10 min. Permitir que as peças para arrefecer antes de prosseguir para o passo seguinte.
11. Desenvolver as peças usando a solução de revelação SU8 durante 20 min. Lavar as peças em álcool isopropílico (IPA) e explodir com gás nitrogênio seco.
12. Colocar as peças de silício em um exsicador com o padrão SU8 no topo. Cubra os pedaços com 50 ul de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor num exsicador durante 2 h.

Precauções: Tome precauções de segurança para a manipulação de produtos químicos durante KOH tratamento, revestimento fotorresiste e em desenvolvimento. Revestimento de vapor de silano deve ser realizada dentro de um secador em uma área ventilada. Proteja SU8 resistir de excesso de exposição à luz. Use óculos de proteção com uma lig UVfonte ht.

2. PDMS fabricação de moldes

1. Prepare 10:01 PDMS pela combinação de 50 g de base de Sylgard 184 com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misturar o conteúdo manualmente para ~ 3 min. Desgaseificar a mistura dentro de um dessecador para remover todas as bolhas de ar formadas durante a mistura.
2. Despeje uma mistura de 5 milímetros de espessura PDMS sobre as pastilhas de silício com SU8 padrão de design II, para a camada de controle, com cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. No caso de as bolhas se formam durante o vazamento, desgaseificar o PDMS no padrão SU8 em baixo vácuo para remover todas as bolhas.
3. Coloque as bolachas de silício com SU8-2025 padrão de projeto que eu, para a camada de fluxo, em mandril giratório e ligue o vácuo para mantê-los. Cobrir as placas com ~ 1 ml de mistura de PDMS e revestir as placas utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 1,500 rpm durante 30 segundos.
4. Casaco ~ 1 ml mistura PDMS em placas de silício com a 80 uM SU8-2050 padrão de desenho I (L1, Figura 1B), para acamada de fluxo para final estágios larvais de C. elegans usando o spinner SPIN150 a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 1000 rpm durante 30 segundos. Casaco de uma espessa camada de mistura de PDMS sobre as peças de silício com SU8-2050 padrão de fluxo de camada de desenho I (L1, Figura 1C), para Drosophila / larvas de peixe zebra, utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 35 segundos.
5. Asse PDMS peças de silício revestido de projeto que eu e bolachas com correspondente projeto II para controle de camada contendo PDMS para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas em um forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 6 horas.
6. Cortar a peça PDMS do substrato de silício contendo o SU8 padrão II para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas usando uma lâmina afiada. Perfurar um furo de pequeno diâmetro de ~ 1 mm na parte superior do reservatório de ligar a armadilha principal no molde PDMS utilizando um perfurador de Harris.
7. Coloque o bloco perfurado PDMS (contendo o molde 40 um de espessura para o controlocamada L2) num tabuleiro de plástico, com o lado da camada moldada de controle para cima. Colocar a placa de silício revestido de PDMS contendo os 40 um desenho SU8 espesso I na mesma bandeja, com a superfície revestida voltada para cima PDMS. Introduza o tabuleiro no interior da câmara de plasma limpo e ligar o vácuo durante 2 min. Subsequentemente, ligar a energia do plasma e reduzir a pressão da câmara até a câmara fica rosa claro na cor. Expor ambas as superfícies a 18 Watt ar plasma sob baixo vácuo durante 2 min.
8. Coloque o bloco perfurado PDMS removidos dos 80 mm de espessura SU8 mestre contendo padrão II para final estágios larvais de C. elegans ou Drosophila / zebrafish larvas numa bandeja de plástico, com o lado da camada moldada de controle para cima. Coloque o spin camada correspondente cozido PDMS revestido na pastilha de silício contendo 80 mm de espessura projeto eu para mais tarde C. elegans etapas ou Drosophila / larvas de peixe zebra, simultaneamente, na mesma bandeja com a parte plana PDMS revestido surface voltado para cima. Usar o mesmo protocolo acima mencionado de os expor ao ar plasma.
9. Coloque as duas superfícies tratadas por plasma C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas, juntamente com uma ligeira pressão e assar no forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 2 horas.
10. Corte os dispositivos ligados a partir do substrato de silício com SU8 projeto que eu para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas. Os orifícios de acesso de perfurador em reservatórios de entrada e saída do canal de fluxo.
11. Coloque o molde PDMS ligado em uma bandeja de plástico para C. elegans, com o lado do desenho moldado camada de fluxo para cima. Lamínula limpa vidro (22 X 22 mm, espessura n º 1) e colocá-lo na mesma bandeja de plástico. Insira a bandeja contendo PDMS molde e deslizamento tampa de vidro no interior da câmara de plasma. Expor a superfície de PDMS parte inferior do dispositivo de deslizamento e tampa de vidro a 18 Watt de plasma de ar a baixa pressão durante 2 min. Coloque as duas superfícies de plasma tratados com gentle pressão e assar no forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 2 horas.
12. Armazenar o dispositivo num ambiente limpo para uso futuro.

3. Etapas adicionais para Drosophila / Zebrafish Dispositivo

1. Expor a superfície de vidro limpo de tamanho 2 cm x 2 cm com 50 ul de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor num exsicador durante 2 h.
2. Spin-~ 1 ml de 10:1 mistura PDMS, preparado no passo 2.1 na superfície de vidro silanizada usando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 35 segundos. Coza os PDMS substratos de vidro revestidos num forno de ar quente a 50 ° C durante 6 horas, com a superfície revestida voltada para cima. Permitir que a camada de PDMS-se arrefecer até à temperatura ambiente antes de prosseguir para o passo seguinte.
3. Soco a camada revestida utilizando um perfurador de metal construído sob encomenda afiado no meio do PDMS, para formar a camada de espaçador PDMS. A forma do perfurador de metal é concebido similar ao desenho do fluxo de Drosophila / peixe-zebra (L1, Figura 1C ).
4. Expor a camada de espaçador PDMS eo single-ligado bloco (camada de fluxo e camada de controle, feita no passo 2,9 para Drosophila / zebrafish larvas) para 18 Watt ar mais limpo utilizando plasma plasma em baixo vácuo. Coloque as duas superfícies de plasma tratadas em conjunto e cozê-los num forno de ar quente a 50 ° C durante 2 horas.
5. Cortar o dispositivo ligado a partir do vidro, os orifícios de acesso de perfuração nos reservatórios de entrada e de saída e de ligação a uma lamela de vidro (22 X 22 mm, espessura No. 1), utilizando um aspirador de plasma, como mencionado no passo 2.11. Isto produziria um dispositivo de imobilização por larvas de primeiro instar de Drosophila, com uma altura de canal de ~ 500 mm. Para larvas do peixe, duplicar o espaçador PDMS processo de fabricação de camada com um passo de ligação adicional. A dupla camada de PDMS-S produz uma altura de canal de 900 | iM durante 30 larvas de peixe-zebra HFP.

Precauções: Evite as partículas de poeira durante a fabricação do dispositivo. Dois plasma de superfície limpas necessita de ser completamente livre de poeira para a ligação adequada. Armazenar os dispositivos num exsicador em situações em que uma sala limpa especial não está disponível a fim de minimizar a acumulação de partículas de pó nos dispositivos.

4. Usando PDMS Membrana

1. Conectar uma extremidade de um tubo de micro-flex (diâmetro interno ~ 1,6 mm, diâmetro externo ~ 4,8 mm) a um regulador de pressão de abastecimento de gás de azoto e a outra extremidade para o reservatório de armadilha principal através de uma agulha de calibre 18 (diâmetro externo ~ 1,25 mm) colado ao tubo. Uma torneira de 3 vias utilizadas no meio do tubo de ligação permite que a aplicação ou a libertação da pressão sobre a membrana.
2. Encher o tubo conectado ao dispositivo de PDMS com uma coluna de 10 cm de água destilada, antes de o ligar ao reservatório da armadilha principal de um C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish dispositivo larvas.
3. Girar a válvula da fonte de azoto de 14 psi ler e monitorizar a membrana da armadilha principal deflexão no sentido thcanal de fluxo e a baixa ampliação de um microscópio invertido. Comprimento da coluna de água no tubo de micro-flex é comprimida quando a torneira de passagem de 3 vias está aberta. Bordas da membrana desviada são visíveis em luz transmitida (Figura 1I e 1J). Deflexão da membrana provocam o deslocamento de partículas de poeira / bolhas sob a membrana PDMS e empurra-los para as fronteiras de canal.
4. Espere até que o líquido enche a frente de microcanais completamente sem qualquer ar aprisionado.
5. Libertar a pressão, utilizando a torneira de passagem de 3 vias para relaxar a membrana para a sua posição de repouso.

5. Inserindo C. elegans, Drosophila e Zebrafish larvas no dispositivo e imobilizando-os sob a membrana PDMS flexível

1. Encher o canal de fluxo com tampão M9 [3 g KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M _MgSO4, H ₂ O a 1 L, esterilizar por autoclaving] para C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, 0,24 g de KH ₂ PO _4, H ₂ O a 1 L, esterilização em autoclave] para Drosophila / 19 larvas de peixe-zebra, durante 10 min antes de uma experiência.
2. Localize uma única C. elegans de estágio obrigatório em uma placa NGM ¹⁸ (ou primeiro larvas Drosophila da placa de ágar ovo ou manualmente dechorionated 30 larvas do peixe hpf em meio líquido ²⁰⁾ usando um microscópio estéreo baixo ampliação. Escolher um único animal usando um pequeno volume de solução tampão para uma ponta de micro. Utilizar uma ponta de micro corte com a sua extremidade para acomodar o maior ou Drosophila zebrafish larvas em tampão.
3. Empurrar o único organismo através da entrada do canal de fluxo. Ajuste a pressão de pipetagem para posicionar o animal individual sob a armadilha principal.
4. Aumentar a pressão da membrana PDMS lentamente para posicionar o animal contra a channel limite e imobilizá-lo, com 14 psi de pressão de C. elegans, 7 psi para Drosophila e 3 psi para larvas do peixe.
5. Posicionar o animal imobilizado no centro do campo de vista microscópico. Use um microscópio invertido em configurações desejadas para o campo de alta resolução brilhante ou imagens de fluorescência. Adquirir um ou lapso de tempo imagens de fluorescência na taxa de quadros predefinido.
6. Solte a pressão armadilha e monitorar a locomoção do animal por 5-10 minutos em baixa ampliação.
7. Lave o animal e inserir um animal fresco para repetir os passos acima.
8. Lave todos os animais do reservatório de resíduos, utilizando água destilada aplicado utilizando uma seringa. Seca-se o canal empurrando ar utilizando uma seringa para reutilização futura.

Precauções: Animais que requerem maior pressão de pipetagem para correr dentro do canal principal tendem a mostrar locomoção ruim / saúde após o lançamento da armadilha e deve ser evitado por imaging. Limpar o canal de fluxo para qualquer traço de solução tampão para evitar o entupimento do canal por cristais. Se o óleo é usado para geração de imagens de alta resolução, limpar a lâmina de cobertura de vidro para ser capaz de manter um bom sinal-ruído para as experiências subsequentes.

Resultados

O dispositivo de imobilização é um bloco de PDMS bicamada fabricadas por colagem de duas camadas: uma camada de fluxo (camada 1) e uma camada de controlo (camada 2), como mostrado na Figura 1. A armadilha principal está ligada a um cilindro de gás de azoto através de um regulador e uma torneira de 3 vias para aplicar pressão (3-14 psi) necessário para a membrana através de uma coluna de líquido (Figura 1A). A membrana é desviado imobiliza C. elegans, Drosophila ou ze...

Discussão

Dispositivos PDMS microfluidicos são opticamente transparentes, por conseguinte, pode ser utilizado em alta resolução em imagiologia in vivo de qualquer organismo modelo transparente / translúcida. Nosso projeto é adequado para alta de ampliação de imagem espaço-temporal de eventos celulares e sub-celular em intactas animais vivos. Microfabricação utilizando técnicas de litografia suave permite uma fácil manipulação de dimensões do dispositivo para vários tamanhos de organismos modelo. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Wafers de silício	Wafer Universidade	150 mm (100) Grade Mech SSP Si
Clewin Software	WieWeb software	Versão 2,90
Plotter Laser	Imagem Fine Line	65.024 DPI
HMDS	Sigma-Aldrich	440.191-100ML
SU8	Microchem	SU8-2025, SU8-2050
Revelador	Microchem	SU8 desenvolvedor
Silano	Sigma-Aldrich	448931-10G
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Lâmpada UV	Janela saliente	66943	200W Hg Oriel Luz
Forno de ar quente	Instrumentos Ultra	Feitos	Ajustado a 50 ° C
Chapa elétrica	Equipamentos de Laboratório IKA	3810000	http://www.ika.com
Aspirador de Plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Fiandeiro	Sistemas de produção de semicondutores	SPIN150-NPP	www.SPS-Europe.com
Lamínula de vidro	Gold Seal	22 X 22 mm, espessura 1 No.
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	e1265, ayIs4
Drosophila	Bloomington	P {chaGAL4} / cio, UAS-syt.eGFP
Zebrafish	Tipo selvagem indiano	Tipo selvagem
Tubo Tygon	Sigma	Z279803
Micro agulha	Sigma	Z118044	Corte em pedaços 1 centímetro
3-way torneira	Sigma	S7521
Perfurador Harris	Sigma	Z708631
Gás comprimido nitrogênio	Fornecedor de gás local		Utilizar um regulador de pressão para controlar a
Microscópio estéreo	Nikon	SMZ645
Microscópio confocal	Andor & Olympus	Yokogawa disco giratório microscópio confocal
ImageJ	National Institutes of Health	www.rsbweb.nih.gov / ij	Java programa de processamento de imagem baseada em