Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Özet

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için geliştirilmiştir In vivo görüntüleme C. elegans, Intakt Drosophila Larva ve zebrafish larva. Cihaz, kalp ritmi, hücre bölünmesi ve hücre altı nöronal ulaşım gibi birçok süreçlerin zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bu model organizmalar hareketsiz bir deforme PDMS membran kullanır. Biz bu cihazın kullanımını göstermek ve farklı model sistemlerinden toplanan verilerin farklı örnekler göstereceğiz.

Özet

Mikro fabrikasyon akışkan cihazları küçük organizmalar üzerinde in vivo çalışmalar için erişilebilir bir mikro-ortam sağlar. Basit üretim işlemlerinde yumuşak litografi teknikleri kullanarak ^1-3 mikroakışkan cihazlar için kullanılabilir. Mikroakışkan cihazlar vivo lazer mikrocerrahi ^2,6 ve hücresel görüntüleme ^4,7 alt hücresel görüntüleme ^4,5, için kullanılmaktadır. Vivo görüntüleme organizmaların immobilizasyon gerektirir. Bu emiş ^5,8 kullanılarak elde edilmiştir, konik kanalların ^6,7,9, deforme membranlar ^2-4,10, ek soğutma ^5, anestezik gaz ^11, ısıya duyarlı jeller ^12, siyanoakrilat yapıştırıcı ¹³ ve böyle levamizol ¹⁴ gibi anestezikler ile emiş ^{, 15.} Yaygın olarak kullanılan anestezik sinaptik iletim ^16,17 etkilemek ve alt hücresel nöronal ulaştırma ⁴ üzerinde zararlı etkileri olduğu bilinmektedir. Bu study biz böyle Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larva ve zebrafish larva gibi bozulmamış genetik model organizmaların anestezik ücretsiz immobilizasyon sağlar poli-dimetil-siloksan (PDMS) aygıtı dayalı bir membran göstermektedir. Bu model organizmalar nedeniyle küçük çaplı ve optik olarak saydam veya yarı saydam cisimlerin mikroakışkan cihazlar in vivo çalışmalar için uygundur. Gövde çapları C. erken larva aşamaları için ~ 10 mikron dan ~ 800 mikron arasında değişir elegans ve zebrafish larva ve yüksek çözünürlüklü time-lapse görüntüleme için tam immobilizasyon elde etmek için farklı boyutlarda mikroakışkan cihazlar gerektirir. Bu organizmalar, bir sıvı sütunu ile sıkıştırılmış azot gazı tarafından uygulanan ve bir inverted mikroskop kullanarak görüntülü basıncı kullanılarak immobilize edilmiştir. Tuzak salınan Hayvanlar 10 dakika içinde normal hareket döner.

Biz C. time-lapse görüntüleme dört uygulamaları göstermek elegansyani nöronların görüntüleme mitokondriyal ulaşım, nakliye kusurlu mutant, glutamat reseptör ulaşım ve Q neuroblast hücre bölünmesinde presinaptik vezikül taşınması. Bu tür filmler elde edilen veriler mikroakış immobilizasyon anestezi uygulanmış hayvanlar (Şekil 3C ve 1J ^4-F) göre, hücresel ve alt-hücresel olayların in vivo veriler elde yararlı bir araçtır ve kesin olduğunu göstermektedir.

Cihaz boyutları C. farklı aşamalarında time-lapse görüntüleme sağlamak için değiştirilmiş elegans, ilk evre Drosophila larva ve zebrafish larva. Duyusal nöronlarda GFP (syt.eGFP) ile etiketlendi synaptotagmin ile işaretlenmiş veziküllerin Ulaştırma bozulmadan ilk evre Drosophila larvaları kolinerjik duyusal nöronlarda eksprese sinaptik vezikül belirteçlerin yönlü hareketi gösterir. Benzer bir cihaz ~ 30 saat sonrası fertilizasyon (HPF) içinde kalp atışı time-lapse görüntüleme yürütmek için kullanılır olmuşturlarva zebrafish. Bu veriler, geliştirdiğimiz basit cihazlar vivo çeşitli hücre biyolojik ve gelişimsel fenomenleri araştırma modeli sistemleri çeşitli uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

Protokol

1. SU8 Usta Fabrikasyon

1. Clewin yazılımını kullanarak mikroakışkan yapıları tasarlama ve devre filmi 8 mikron asgari özellik boyutu ile 65.024 DPI lazer plotter ile yazdırabilirsiniz.
2. Akış tabakası ve ilgili kontrol katmanı için bir gofret her; 1 dk ve deiyonize su ile durulayın için% 20 KOH yerli oksit ile 2 cm X 2 cm lik silikon gofret temizleyin.
3. Azot gazı ile parçaları kurulayın ve 4 saat boyunca 120 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde kurutmak üfleyin. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
4. Sıra silikon parçaları eğiren mandren bir seferde bir ve vakum açın. ~ 20 ul heksametil-disilazane (HMDS) ve ceket onları kullanarak bir sn 30 sn için 3.000 rpm ardından 5 için 500 rpm'de SPIN150 spinner. Sahip silisyum yüzeylerde Kapak
5. SU8-2025 ~ 1.5 ml (tamamen silikon gofret Kapak http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) ve 5 saniye boyunca 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak kat gofret 30 sn 2.000 rpm izledi. Bu, iplik protokol C larva erken aşamaları için kontrol ve akış tabakalar için uygun olan ~ 40 um kalınlıkta bir fotorezist üretir elegans.
6. Spin ~ 5 için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak 1.5 ml SU8-2050 sn C. geç larva aşamaları için akış tabakası imalatı için uygundur ~ 80 mikron bir fotorezist kalınlık elde etmek için 30 sn 2.000 rpm izledi elegans, Drosophila / zebrafish larva ve bunlara karşılık gelen kontrol tabakaları için bazal akış katmanı.
7. Üstüne SU8 kaplı tabakası ile sıcak plaka üzerinde silikon parçalarını yerleştirin. Yumuşak fırında 65 silikon kaplanmış parçalar ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de, ardından 1 dakika için. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
8. SU8-2025 kaplamalı sur ile pozlama sahnede yumuşak pişmiş silikon parçalarını yerleştirinUV lamba bakan üst yüzü. C. erken larva evreleri için sırasıyla akış katmanı ve kontrol katmanı desen tasarımı I (L1, Şekil 1B) ve tasarımı II (L2, Şekil 1B) ile fotoğraf maske kullanın elegans. SU8 tabakasının üstüne fotoğraf maske yerleştirin ve maske kaplamalı katmanı karşı düz olduğundan emin olun. UV lamba deklanşör açın ve 15 saniye boyunca fotoğraf maske ile 200 Watt UV lamba yumuşak pişmiş SU8 gofret maruz kalmaktadır.
9. C. geç larva evreleri için akış katmanı ve kontrol katmanı üretmek için (adım 1.6 hazırlanmış) SU8-2050 kaplı parçalar üzerinde tasarımı I (L1, Şekil 1B) ve tasarımı II (L2, Şekil 1B) ile fotoğraf maske kullanın elegans. (I hazırlanan SU8-2050 ile kaplı gofret üzerine Drosophila / zebrafish larvalar için sırasıyla bazal akış katmanı ve kontrol katmanı için tasarım I (L1, Şekil 1C) ve tasarımı II (L2, Şekil 1C) ile fotoğraf maske kullanınn adım 1.6). 15 sn için 200 Watt UV lamba fotoğrafı maske aracılığıyla SU8 yüzeyleri açığa.
10. Üstüne kaplı tabakası ile sıcak bir plaka üzerinde maruz silikon parçalarını yerleştirin. 10 dakika boyunca 95 ° C'de, ardından 1 dakika süreyle 65 ° C 'de fırında gofret nakledin. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce soğumasını bekleyin.
11. 20 dakika için SU8 geliştirici çözelti kullanılarak parçalar geliştirin. Izo-propil alkol (IPA) içinde parçalar durulayın ve kuru nitrojen gazı kullanılarak darbe.
12. Üst SU8 desen ile bir desikatör içinde silikon parçalarını yerleştirin. Tricholoro 50 ul (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 saat için bir desikatör içinde silan buhar ile kaplayın adettir.

Önlemler: KOH tedavisi, fotorezist kaplama ve gelişmekte sırasında kimyasal çalışmalar için güvenlik önlemleri alın. Silan buhar kaplama bir havalandırılan bir desikatör içinde yapılmalıdır. Koru SU8 ışığa maruz yerinden direnirler. Bir UV lig ile koruyucu gözlük kullanınht kaynağı.

2. PDMS Kalıp İmalatı

1. Plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g Sylgard 184 taban 50 g birleştirilmesi ile 10:01 PDMS hazırlayın. ~ 3 dakika boyunca elle içeriği karıştırın. Karıştırma sırasında oluşan tüm hava kabarcıklarını çıkarmak üzere bir desikatör içinde Degas karışımı.
2. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaşça, kontrol katmanı için, tasarım II SU8 deseni ile silikon gofret üzerinde 5 mm kalınlığında PDMS karışımı dökün. Kabarcıklar halinde bütün kabarcıklarını çıkarmak için düşük vakum içinde SU8 model üzerinde, gazdan arındırmak PDMS dökme sırasında oluşur.
3. Spinner mandrenin, akış katmanı için, tasarım I SU8-2025 modeli ile silikon gofret yerleştirin ve onları tutmak için vakum açın. ~ 1 PDMS karışımı ml ve kat 5 için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak gofret gofret örtün sn 30 sn için 1.500 rpm izledi.
4. Coat ~ tasarımı I (L1, Şekil 1B) SU8-2050 model 80 mikron ile silikon gofret 1 ml PDMS karışımı içinC. geç larva aşamaları için akım katmanı 5 saniye için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak elegans 30 sn için 1.000 rpm izledi. Coat 35 sn için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak Drosophila / zebrafish larvalar için akış katmanlı tasarımı I (L1, Şekil 1C) SU8-2050 modeli ile silikon parçaları üzerinde PDMS karışımı kalın bir tabaka.
5. Tasarım Bake PDMS kaplamalı silikon parçaları I ve kontrol katmanı için uygun tasarım II ile gofret C için PDMS içeren 50 bir sıcak hava konveksiyon fırında elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva ° 6 saat boyunca C.
6. C. için SU8 desen II içeren silikon substrat PDMS parça kesip elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva keskin bir bıçak kullanarak. Harris bir zımba kullanarak PDMS kalıp içinde ana tutucu bağlantı rezervuar üzerinde ~ 1 mm çapında küçük bir delik.
7. Delikli PDMS blok (kontrol için 40 mikron kalınlığında kalıp içeren yerleştirinyukarı bakacak şekilde kontrol tabakası ile kalıplanmış yan tepsi üstünde bir plastik tabaka L2). PDMS kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde, aynı tepsiye 40 mikron kalınlığında SU8 tasarımı I içeren PDMS kaplı silikon gofret yerleştirin. Plazma temizleyici hücresinde tepsisini takın ve 2 dakika süreyle vakum açın. Daha sonra, plazma gücü açın ve odanın rengi açık pembe olana kadar odasının basıncını düşürebilir. 2 dakika için düşük vakum altında 18 Watt hava plazma için her iki yüzey Açığa.
8. C. geç larva evreleri için kalın SU8 usta içeren deseni II 80 mikron kaldırılır yumrukladı PDMS blok yerleştir yukarı bakacak şekilde kontrol tabakası ile kalıplanmış yan tepsi üstünde bir plastik ya da elegans Drosophila / zebrafish larva. Daha sonra C. I 80 mikron kalınlığında tasarımı içeren silikon gofret üzerine kaplanmış gelen pişmiş PDMS katmanı sıkma yerleştirin elegans aşamalarında veya düz PDMS kaplı s ile aynı tepsiye aynı anda Drosophila / zebrafish larvaurface yukarı bakacak. Aynı protokolü kullanın plazma hava almaları için yukarıda.
9. C. için iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirin elegans ve / ya da birlikte hafif bir basınç ve 2 saat boyunca 50 ° C 'de bu sıcak hava konveksiyon fırını içinde fırında ile Drosophila / zebrafish larvası.
10. C. için SU8 tasarımı ile silikon substrat gümrüklü cihazlar Kes elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva. Punch erişim akış kanal giriş ve çıkış depoları delikler.
11. C. için bir plastik tepsi üzerinde gümrüklü PDMS kalıp yerleştirin yukarı bakacak akış katmanlı tasarım kalıp tarafı elegans. Temiz cam kapak kayma (22 X 22 mm, No 1 kalınlığı) ve aynı plastik tepsi üzerine yerleştirin. PDMS kalıp ve plazma odasının iç cam kapak kayma içeren kaseti takın. Alt cihazın PDMS yüzey ve cam kapak slipi ila 18 2 dk için düşük basınç altında Vat hava plazma Açığa. Gen ile iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirinTLE basınç ve 2 saat boyunca 50 ° C 'de bu sıcak hava konveksiyon fırını içinde fırında.
12. Ileride kullanmak üzere temiz bir ortamda cihazı saklayın.

3. Drosophila / Zebra balığı Cihaz için ek adımlar

1. Temiz bir cam yüzey boyutu 2 cm tricholoro 50 ul ile x 2 cm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 saat için bir desikatör içinde silan buhar. Açığa
2. Spin ~ 35 sn için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak Silanlanmış cam yüzey üzerinde adım 2.1 'de hazırlanan 10:01 PDMS karışımı 1 ml. Yukarı bakacak kaplamalı yüzey 6 saat boyunca 50 ° C sıcaklıkta sıcak hava fırında PDMS kaplı cam yüzeyler pişirin. PDMS katmanı sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
3. Punch PDMS ayırıcı tabaka oluşturur, PDMS ortasında özel yapılmış bir keskin metal zımba kullanarak kaplı tabaka. Metal zımba şekli, Drosophila / zebrafish için akış tasarımı (L1, Şekil 1C benzer tasarlanmıştır ).
4. PDMS ara katman ve düşük vakumlu plazma temizleyici kullanarak tek gümrüklü blok (Drosophila / zebrafish larvaları için adım 2.9 'da yapılan akışı katman ve kontrol katmanı), 18 Watt hava plazma maruz. Birlikte iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirin ve 50 bir sıcak hava fırın ° C'de 2 saat boyunca bunları fırında.
5. Cam gümrüklü cihaz kesin, giriş ve çıkış depoları ve adım 2.11 'da belirtildiği gibi bir plazma temizleyici kullanarak cam bir kapak kayma (22 X 22 mm, 1 Nolu kalınlık) tahvil ona yumruk erişim delikleri. Bu ~ 500 mikron bir kanal yüksekliği ile ilk evre Drosophila larvaları için bir immobilizasyon cihaz üretecek. Zebra balığı larvaları için, ek bir bağ adım PDMS ara katman üretim süreci çoğaltabilirsiniz. PDMS-S ikili tabaka 30 HFP zebrafish larvaları için 900 um arasında bir kanal yüksekliğini üretir.

Önlemler: Cihaz üretim sırasında toz parçacıkları kaçının. İki plazma yüzey temizliğilar uygun bağların için ücretsiz tamamen toz olması gerekir. Özel bir temiz oda cihazları içinde toz parçacıklarının birikimi en aza indirmek için uygun olmadığı durumlarda bir desikatör içinde cihazları saklayın.

4. PDMS membranı kullanılarak

1. 18 gauge iğne (dış çap ~ 1,25 mm) sayesinde basınçlı azot gazı kaynağı regülatör ve ana tuzak rezervuar diğer ucunu bir mikro-flex boru (iç çapı ~ 1.6 mm, dış çapı ~ 4.8 mm) bir ucunu tüp yapıştırılmış. Boru bağlantısının orta kullanılan bir 3-yollu musluk zar üzerinde uygulama ya da basınç serbest bırakma sağlar.
2. Bir C. ana tuzak rezervuar bağlamadan önce distile su ile 10 cm kolon PDMS cihaza bağlanmış boru Dolgu elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva cihaz.
3. 14 psi ve okuma inci yönünde saptırma ana tuzak zar izlemek için azot tedarik vanayıbir inverted mikroskop düşük büyütmede e akış kanalı. Mikro-flex tüp içinde su kolonunun 3 yollu musluk açık olduğunda sıkıştırılır. Deflected membran kenarları iletilen ışık (Şekil 1I ve 1J) görülebilir. Membran saptırma PDMS membran altında toz parçacıkları / kabarcıklar değiştirme nedenleri ve kanal sınırları onları iter.
4. Sıvı ön sıkışan hava olmadan tamamen mikrokanal doldurur kadar bekleyin.
5. Onun dinlenme pozisyonu için zar rahatlamak için 3-yollu musluk kullanılarak basınç serbest bırakın.

5. C. takma elegans, Drosophila ve Zebra balığı Cihaz içine Larva ve Esnek PDMS Membran altında Onları Hareketsizleştirici

1. M9 tampon ile akış kanalı doldurun [3 g KH ₂ PO _4, 6 gr Na ₂ HPO _4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M _MgSO4, 1 L _H2O, aut ile sterilizeoclaving] C için elegans 18 ya da 1X PBS bir 10 dakika süreyle daha önce Drosophila / zebrafish larvaların 19 [8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 gr Na ₂ HPO _4, 0.24 g KH ₂ PO _{4, H2O} 1 L için, otoklav ile sterilize] deney.
2. Tek bir C. bulun düşük bir büyütme stereo mikroskop kullanılarak NGM plaka ¹⁸ gerekli sahne elegans (veya agar yumurta plaka veya sıvı ortamda ²⁰ elle dechorionated 30 hpf zebrafish larva ilk evre Drosophila larvaları). Bir mikro ucu içine tampon solüsyonunun küçük hacimli kullanarak tek bir hayvan seçin. Sonuna bir mikro ucu kullanın büyük Drosophila veya arabellekte zebrafish larva karşılamak için kesti.
3. Akış kanalı giriş aracılığıyla tek bir organizma itin. Ana tuzak altında bireysel hayvan konumlandırmak için pipetleme basıncını ayarlayın.
4. Yavaş yavaş kanal karşı hayvan konumlandırmak için PDMS membran basınç artışınel sınır ve C için 14 psi basınç ile hareketsiz elegans, Drosophila ve zebrafish larvaları için 3 psi 7 psi.
5. Görüş mikroskobik alanının merkezinde immobilize hayvan yerleştirin. Yüksek çözünürlüklü parlak alan veya floresan görüntüleme için istenen ayarları bir inverted mikroskop kullanın. Önceden kare hızında tek veya time-lapse floresans görüntüler elde edin.
6. Tuzak basıncı bırakın ve düşük büyütmede 5-10 dakika süreyle hayvan lokomosyon izlemek.
7. Hayvan yıkayın ve yukarıdaki adımları tekrarlamanız taze hayvan yerleştirin.
8. Bir şırınga kullanılarak uygulanabilir distile su kullanılarak atık rezervuar tüm hayvanlar yıkayın. Gelecekte yeniden kullanım için bir şırınga kullanarak hava basarak kanal kurulayın.

Önlemler: ana kanal içindeki akış yüksek pipetleme basınç gerektiren Hayvanlar tuzaktan yayımlanmasından sonra kötü lokomosyon / sağlık göstermek eğilimindedir ve ima için kaçınılmalıdırging. Kristaller tarafından kanalın tıkanmasını önlemek için tampon herhangi bir iz için akış kanalı temizleyin. Yağ, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılması durumunda, daha sonraki deneyler için gürültü oranı iyi bir sinyal vermeye devam edebilmek için cam kapak slipi temizleyin.

Sonuçlar

Bir akış katmanda (Layer 1) ve bir kontrol katmanı (Katman 2) Şekil 1'de gösterildiği gibi: immobilizasyon cihazı bağ iki tabaka tarafından uydurulan bir bilayeri PDMS bloğudur. Ana tutucu bir regülatör ve bir sıvı kolonu (Şekil 1A) vasıtasıyla zar üzerine gerekli (3-14 psi) basınç uygulamak için bir 3-yollu kapama vanası yoluyla bir nitrojen gaz silindiri ile bağlanır. Deflected membran C. durağanlaştırır Farklı boyutları (Şekil 1B

Tartışmalar

PDMS microfluidic cihazlar bu nedenle herhangi bir yarı saydam / şeffaf model organizma ve in vivo görüntüleme yüksek çözünürlük için kullanılan optik olarak transparan vardır. Bizim tasarım bozulmadan canlı hayvan hücresel ve alt hücresel olayların yüksek büyütme uzay-zamansal görüntüleme için uygundur. Yumuşak litografi teknikleri kullanarak Mikro ve model organizmaların çeşitli boyutlar için cihaz boyutları kolay manipülasyon sağlar. Çeşitli büyüklüklerde aygıtlar ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Silikon gofret	Üniversite gofret	150 mm (100) Makine Sınıf SSP Si
Clewin Yazılım	WieWeb yazılım	Sürüm 2.90
Lazer çizici	Güzel Hat Görüntüleme	65024 DPI
HMDS	Sigma-Aldrich	440191-100ML
SU8	MICROCHEM	SU8-2025, SU8-2050
Geliştirici	MICROCHEM	SU8 Geliştirici
Silan	Sigma-Aldrich	448931-10G
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
UV lamba	Cumba	66943	200W Hg Oriel Işık
Sıcak hava fırını	Ultra Aletleri	Özel yapılmış	50 ° C 'de ayarlama
Sıcak plaka	IKA Laboratuvar Cihazları	3810000	http://www.ika.com
Plazma temizleyici	Harrick Plazma	PDC-32G
Topaç	Yarıiletken Üretim Sistemleri	SPIN150-NPP	www.SPS-Europe.com
Cam kapak kayma	Gold Seal	22 X 22 mm, No 1 kalınlığı
C. elegans	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)	e1265, ayIs4
Drosophila	Bloomington	P {chaGAL4} / CYO, UAS-syt.eGFP
Zebra balığı	Hint vahşi tip	Yabani tip
Tygon tüpü	Sigma	Z279803
Mikro iğne	Sigma	Z118044	1 cm parçalar halinde kesilmiş
3 yollu musluk	Sigma	S7521
Harris puncher	Sigma	Z708631
Sıkıştırılmış nitrojen gazı	Yerel Gaz tedarikçisi		Basıncını kontrol etmek için bir düzenleyici kullanın
Stereo mikroskop	Nikon	SMZ645
Konfokal mikroskop	Andor & Olympus	Yokogawa dönen disk konfokal mikroskop
ImageJ	Ulusal Sağlık Enstitüleri	www.rsbweb.nih.gov / ij	Java tabanlı görüntü işleme programı