JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وقد تم تطوير جهاز بسيط ميكروفلويديك لأداء مخدر مجانا في الجسم الحي تصوير C. ايليجانس، سليمة ذبابة الفاكهة اليرقات واليرقات الزرد. الجهاز يستخدم غشاء PDMS تشوه في شل هذه الكائنات نموذج لأداء التصوير مرور الوقت عمليات عديدة مثل ضربات القلب، انقسام الخلايا وشبه الخلوية النقل العصبية. نحن لشرح استخدام هذا الجهاز، وتظهر أمثلة على أنواع مختلفة من البيانات التي تم جمعها من أنظمة نموذجا مختلفا.

Abstract

مايكرو الأجهزة fluidic ملفقة توفير الوصول الجزئي للبيئة في الدراسات المجراة على الكائنات الصغيرة. عمليات تصنيع بسيطة متوفرة لأجهزة ميكروفلويديك باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة 1-3. وقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك لشبه الخلوية التصوير 4،5، في الجسم الحي ليزر 2،6 المجهرية والخلوية التصوير 4،7. في الجسم الحي التصوير يتطلب تجميد الكائنات الحية. وقد تحقق ذلك باستخدام الشفط 5،8، 6،7،9 قنوات مدبب، الأغشية تشوه 2-4،10، مع شفط تبريد إضافية 5، مخدر الغاز 11، درجة حرارة المواد الهلامية الحساسة 12، 13 و الغراء CYANOACRYLATE التخدير مثل الليفاميزول 14 ، 15. يشيع استخدام التخدير تؤثر انتقال متشابك و16،17 ومن المعروف أن يكون لها آثار ضارة على شبه الخلوية 4 النقل العصبية. في هذا شudy نظهر غشاء بولي ميثيل يعتمد-siloxane (PDMS) الجهاز الذي يسمح مخدر تجميد سليمة خالية من الكائنات نموذج الوراثية مثل ايليجانس Caenorhabditis (C. ايليجانس)، ذبابة الفاكهة اليرقات واليرقات الزرد. هذه الكائنات هي مناسبة لنموذج من الدراسات المجراة في أجهزة ميكروفلويديك بسبب صغر أقطار والهيئات شفافة بصريا أو شفافة. بأقطار تتراوح من الجسم ميكرومتر ميكرومتر إلى 10 ~ 800 ~ للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس والزرد اليرقات وتتطلب الأجهزة ميكروفلويديك من مختلف الأحجام لتحقيق الشلل الكامل لارتفاع الوقت الفاصل بين التصوير القرار. وثبتوا هذه الكائنات باستخدام الضغوط التي مارستها غاز النيتروجين المضغوط من خلال عمود السائل وتصويرها باستخدام مجهر مقلوب. صدر الحيوانات من مصيدة العودة إلى طبيعته في غضون تنقل 10 دقيقة.

علينا أن نبرهن أربعة طلبات من الوقت الفاصل بين التصوير في C. ايليجانسوهي التصوير النقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية، ما قبل متشابك الحويصلة النقل في النقل عيب متحولة والنقل مستقبلات الغلوتامات وس انقسام الخلايا أرومة عصبية. البيانات التي تم الحصول عليها من مثل هذه الأفلام تظهر أن تجميد ميكروفلويديك هو وسيلة مفيدة ودقيقة في الحصول على البيانات الجسم الحي للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بالمقارنة مع الحيوانات تخدير (الشكل 3C 1J و 4-F).

تم تغيير أبعاد الجهاز لإتاحة الوقت الفاصل بين التصوير من مراحل مختلفة من C. ايليجانس، أولا يرقات ذبابة الفاكهة واليرقات الزرد الطور. نقل الحويصلات التي تحمل علامة synaptotagmin ذات الكلمات الدلالية مع GFP (syt.eGFP) في الخلايا العصبية الحسية تظهر الحركة الموجهة من علامات حويصلة متشابك المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية سليمة العاملات في 1 يرقات ذبابة الفاكهة الطور. وقد استخدم جهاز مماثل لتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير من نبضات القلب خلال 30 ساعة ~ الإخصاب آخر (HPF)الزرد اليرقات. هذه البيانات تظهر أن يمكن تطبيق أجهزة بسيطة وضعنا لمجموعة متنوعة من نظم نموذجية لدراسة الظواهر البيولوجية والخلية عدة التنموية في الجسم الحي.

Protocol

1. SU8 ماجستير التصنيع

  1. تصميم هياكل ميكروفلويديك باستخدام Clewin البرمجيات وطباعته باستخدام الليزر الراسمة 65024 DPI مع حجم ميزة الحد الأدنى من 8 ميكرون على الفيلم وحات الدارات الكهربائية.
  2. تنظيف 2 سم X سم 2 رقائق السيليكون مع أكسيد الأصلي في KOH 20٪ لمدة 1 دقيقة وشطف في الماء منزوع الأيونات، واحد في كل من رقاقة طبقة وطبقة تدفق الرقابة المقابلة.
  3. ضربة الجافة القطع مع غاز النيتروجين ويذوى على لوحة الساخن 120 ° C في لمدة 4 ساعة. السماح للقطع لتهدئة لدرجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.
  4. قطعة السيليكون مكان واحد في وقت واحد على تشاك الدوار وتشغيل الفراغ. تغطية الأسطح السيليكون مع 20 ميكرولتر ~ disilazane-سداسي (HMDS) ومعطف لهم باستخدام ملف. SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى ثم 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية
  5. تغطية رقائق السليكون تماما مع 1.5 مل من 2025 ~-SU8 ( الإلكتروني http://يتبع www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) ورقائق معطف باستخدام SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى من 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. هذا البروتوكول الغزل ينتج مقاومة للضوء من سمك ميكرومتر 40 ~ التي هي مناسبة لمراقبة وطبقات تدفق للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس.
  6. تدور ~ 1.5 مل SU8-2050 باستخدام SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى ثم 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على سمك مقاومة للضوء من ميكرون 80 ~ التي هي مناسبة لتصنيع طبقة تدفق للمراحل المتأخرة من اليرقات C. ايليجانس، القاعدية طبقة تدفق لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات والسيطرة على الطبقات المقابلة.
  7. ضع قطعة السيليكون على لوحة الساخن مع طبقة المغلفة SU8 على القمة. لينة خبز القطع المغلفة السيليكون في 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها C ° 95 لمدة 10 دقيقة. السماح للقطع لتهدئة لدرجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.
  8. ضع قطعة خبز السيليكون لينة على المسرح مع التعرض SU8-2025 سور المغلفةوجه على رأس تواجه مصباح الأشعة فوق البنفسجية. استخدام قناع الصورة مع التصميم I (L1، 1B الشكل) والتصميم الثاني (L2، 1B الشكل) للطبقة تدفق ومراقبة نمط طبقة على التوالي للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس. وضع قناع الصورة في أعلى طبقة SU8 وضمان القناع المسطحة ضد طبقة المغلفة. فتح مصراع من مصباح الأشعة فوق البنفسجية وفضح ينة خبز رقائق SU8 إلى 200 واط مصباح الأشعة فوق البنفسجية من خلال القناع لمدة 15 ثانية الصورة.
  9. استخدام قناع الصورة مع التصميم I (L1، 1B الشكل) والتصميم الثاني (L2، 1B الشكل) على SU8-2050 قطعة مغلفة (أعدت في الخطوة 1.6) لصنع طبقة وطبقة تحكم تدفق للمراحل المتأخرة من اليرقات C. ايليجانس. استخدام قناع الصورة مع التصميم I (L1، الشكل 1C) والتصميم الثاني (L2، الشكل 1C) للطبقة القاعدية وتدفق طبقة تحكم على التوالي لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات على رقائق مغلفة عام 2050 SU8 (أعددتن الخطوة 1.6). كشف الأسطح SU8 من خلال قناع الصورة إلى 200 واط مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية.
  10. ضع قطعة السيليكون تعرض على لوحة الساخن مع طبقة المغلفة على القمة. أضف خبز رقائق في C ° 65 لل1 دقيقة تليها C ° 95 لمدة 10 دقيقة. تسمح القطع ليبرد قبل الشروع في الخطوة التالية.
  11. تطوير القطع باستخدام الحل المطور SU8 لمدة 20 دقيقة. شطف القطع في ISO-بروبيل الكحول (IPA) وضربة الجافة باستخدام غاز النيتروجين.
  12. ضع قطعة السيليكون داخل مجفف مع نمط SU8 على القمة. معطف القطع مع 50 ميكرولتر من tricholoro (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) بخار سيلاني داخل مجفف لمدة 2 ساعة.

الاحتياطات: خذ احتياطات السلامة للتعامل مع المواد الكيميائية أثناء العلاج KOH، طلاء مقاوم الضوء والنامية. يجب أن يتم تنفيذ سيلاني بخار طلاء داخل مجفف في منطقة جيدة التهوية. حماية SU8 مقاومة من خلال التعرض للضوء. استخدام النظارات الواقية مع التركي الممتاز UVحزب التحرير المصدر.

2. PDMS العفن التصنيع

  1. إعداد 10:01 PDMS من خلال الجمع بين 50 غ من قاعدة Sylgard 184 مع 5 غ من وكيل علاج في كوب من البلاستيك. تخلط المحتويات يدويا عن حد أدنى 3 ~. ديغا الخليط داخل مجفف لإزالة جميع فقاعات الهواء تشكلت خلال الخلط.
  2. صب الخليط 5 مم PDMS سميكة على رقائق السليكون مع SU8 نمط الثاني للتصميم، للطبقة تحكم، بلطف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. في حال شكلت خلال فقاعات تتدفق، وديغا PDMS على نمط SU8 في فراغ الأقل إلى إزالة كافة الفقاعات.
  3. وضع رقائق السليكون مع SU8-2025 نمط تصميم I، للطبقة التدفق، على تشاك الدوار وتشغيل الفراغ لانعقادها. تغطية رقائق مع 1 مل من مزيج ~ PDMS ومعطف باستخدام رقائق SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى ثم من 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  4. معطف ~ 1 مل مزيج PDMS على رقائق السليكون 80 ميكرومتر مع SU8-2050 نمط تصميم I (L1، 1B الشكل)، لطبقة تدفق للمراحل المتأخرة من اليرقات C. يتبع ايليجانس باستخدام الدوار SPIN150 في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى من 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. معطف طبقة سميكة من المزيج على قطع PDMS السيليكون مع SU8-2050 نمط طبقة تدفق I تصميم (L1، الشكل 1C) لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات، وذلك باستخدام SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 35 ثانية.
  5. تخبز قطع PDMS المغلفة السيليكون للتصميم الأول والثاني للتصميم رقائق مع المقابلة للطبقة التحكم التي تحتوي على PDMS لC. ايليجانس و / أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات في فرن الهواء الساخن الحراري في 50 ° C لمدة 6 ساعة.
  6. قطع قطعة من PDMS الركيزة السيليكون التي تحتوي على نمط II SU8 لC. ايليجانس و / أو يرقات ذبابة الفاكهة / الزرد باستخدام شفرة حادة. لكمة ثقب صغير بقطر 1 مم ~ على أعلى من الخزان الرئيسي الذي يربط بين فخ في قالب PDMS باستخدام الناخس هاريس.
  7. وضع كمات PDMS كتلة (التي تحتوي على العفن سميكة 40 ميكرون من أجل السيطرةطبقة L2) على صينية من البلاستيك، مع الجانب مصبوب من طبقة التحكم مواجهة. وضع رقاقة السيليكون PDMS المغلفة التي تحتوي على 40 ميكرومتر سميكة SU8 تصميم I على علبة نفسه، مع سطح PDMS المغلفة لأعلى. أدخل الدرج داخل غرفة الأنظف البلازما وتشغيل الفراغ لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل الطاقة البلازما وخفض ضغط غرفة غرفة حتى يتحول ردي فاتح اللون. فضح كل من الأسطح إلى 18 وات الهواء البلازما تحت فراغ منخفضة لمدة 2 دقيقة.
  8. وضع كتلة PDMS كمات إزالتها من ميكرون سميكة 80 SU8 الرئيسية المحتوية على نمط II لمراحل متأخرة من اليرقات C. ايليجانس أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات على صينية من البلاستيك، مع الجانب مصبوب من طبقة التحكم مواجهة. وضع طبقة PDMS المقابلة خبز تدور المغلفة على رقاقة السيليكون تحتوي على 80 ميكرومتر سميكة تصميم I لاحقا C. ايليجانس مراحل أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات في وقت واحد على الدرج نفسه مع ليالي شقة المغلفة PDMSurface مواجهة. ذكر استخدام نفس البروتوكول السابق لليعرضهم لبلازما الهواء.
  9. وضع السطوح البلازما 2 المعالجة لC. ايليجانس و / أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات مع ضغط لطيف وخبز لهم في الهواء الساخن في الفرن الحراري C ° 50 لمدة 2 ساعة.
  10. قطع الأجهزة المستعبدين من الركيزة السيليكون مع تصميم I SU8 لC. ايليجانس و / أو يرقات ذبابة الفاكهة / الزرد. الثقوب لكمة في وصول خزانات مدخل ومخرج للقناة التدفق.
  11. مكان القالب PDMS المستعبدين على صينية من البلاستيك لC. ايليجانس، مع الجانب مصبوب من تدفق تصميم طبقة مواجهة. نظيفة زلة غطاء الزجاج (22 X 22 مم، سماكة رقم 1) ووضعها على علبة من البلاستيك نفسه. أدخل الدرج تحتوي على العفن PDMS والزجاج غطاء زلة داخل غرفة البلازما. كشف سطح PDMS السفلي من الجهاز والزجاج غطاء زلة إلى 18 وات البلازما الجوية في الضغط المنخفض لمدة 2 دقيقة. وضع السطوح البلازما 2 تعامل مع الجنرالTLE الضغط وخبز لهم في الهواء الساخن في الفرن الحراري C ° 50 لمدة 2 ساعة.
  12. حافظ على بقاء الجهاز في بيئة نظيفة لاستخدامها في المستقبل.

3. خطوات إضافية لذبابة الفاكهة / جهاز اسماك الزرد

  1. كشف نظيفة سطح الزجاج من حجم 2 سم X 2 سم مع 50 ميكرولتر من tricholoro (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) بخار سيلاني داخل مجفف لمدة 2 ساعة.
  2. تدور ~ 1 مل من مزيج PDMS 10:01 أعدت في الخطوة 2.1 على سطح الزجاج باستخدام silanized SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 35 ثانية. خبز ركائز الزجاج المطلي PDMS في فرن الهواء الساخن في C ° 50 ساعة لمدة 6 مع السطح المطلي مواجهة. السماح للطبقة PDMS لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.
  3. لكمة طبقة المغلفة باستخدام مخصص بنيت الناخس معدنية حادة في منتصف PDMS، لتشكيل طبقة PDMS التبادل. تم تصميم شكل الناخس معدنية مماثلة في تصميم لتدفق ذبابة الفاكهة / الزرد (L1، الشكل 1C ).
  4. فضح طبقة التبادل PDMS واحد المستعبدين كتلة (طبقة وطبقة تدفق السيطرة، في الخطوة 2.9 لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات) إلى 18 وات الهواء النظيف باستخدام البلازما البلازما في فراغ منخفضة. وضع السطوح البلازما 2 تعامل معا وخبز لهم في فرن الهواء الساخن عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. قطع الجهاز المستعبدين من الزجاج، والثقوب لكمة في وصول خزانات مدخل ومخرج والسندات لتغطية زلة كوب (22 X 22 مم، سماكة رقم 1) باستخدام منظف البلازما كما ذكر في الخطوة 2.11. هذا من شأنه أن ينتج عبوة الشلل لأول اليرقات طور مرحلي ذبابة الفاكهة مع ارتفاع قناة ميكرومتر 500 ~. ليرقات اسماك الزرد، مكررة طبقة PDMS التبادل مع عملية تصنيع خطوة الترابط إضافية. طبقة مزدوجة من PDMS-S تنتج على ارتفاع من 900 قناة لمدة 30 ميكرومتر اليرقات الزرد HFP.

الاحتياطات: تجنب ذرات الغبار أثناء تصنيع الجهاز. اثنين البلازما تنظيف سطحق يجب أن تكون خالية تماما الغبار عن الترابط الصحيح. تخزين الأجهزة داخل مجفف في الحالات التي غرفة خاصة نظيفة غير متوفرة من أجل تقليل تراكم الغبار في الأجهزة.

4. باستخدام غشاء PDMS

  1. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب الصغير المرن (القطر الداخلي 1.6 مم ~، ~ القطر الخارجي 4.8 ملم) لمنظم الضغط النيتروجين امدادات الغاز والطرف الآخر إلى الخزان الرئيسي من خلال فخ إبرة قياس 18 (القطر الخارجي ~ 1.25 مم) لصقها على أنبوب. A 3-محبس الطريقة المستخدمة في منتصف اتصال أنبوب يسمح التطبيق أو إطلاق الضغط على الغشاء.
  2. ملء الأنبوب متصلا الجهاز PDMS مع عمود 10 سم من الماء المقطر قبل توصيله إلى الخزان من فخ الرئيسية للC. ايليجانس و / أو ذبابة الفاكهة / الزرد الجهاز اليرقات.
  3. تحويل صمام توريد النيتروجين ليلي: 14 PSI ورصد غشاء من فخ الرئيسي تشتيت نحو اله قناة تدفق تضخم منخفضة من مجهر مقلوب. يتم ضغط طول عمود الماء في أنبوب الصغير المرن كلما محبس 3-الطريق مفتوح. حواف الغشاء تهرب واضحة في الضوء المرسل (الشكل 1I و1J). انحراف الغشاء يسبب تشريد جزيئات الغبار / فقاعات تحت الغشاء PDMS ويدفعهم إلى حدود القناة.
  4. الانتظار حتى الجبهة السائل يملأ متناهية تماما دون أي الهواء المحبوس.
  5. الافراج عن الضغط باستخدام محبس 3-سيلة للاسترخاء الغشاء إلى موقعها الراحة.

5. إدراج C. ايليجانس، وذبابة الفاكهة اسماك الزرد اليرقات في الجهاز والشل منهم تحت الغشاء PDMS مرنة

  1. ملء قناة تدفق العازلة M9 مع [3 غ KH 2 PO 4 و 6 ز نا 2 HPO 4 و 5 ز كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgSO 4، H 2 O إلى 1 L، تعقيم بواسطة التسليمoclaving] لC. ايليجانس 18 أو 1X PBS [8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 ز بوكل، 1.44 ز نا 2 HPO 4، 0،24 ز KH 2 PO 4، H 2 O إلى 1 L، تعقيم بواسطة التعقيم] لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات (19) ل10 دقيقة قبل التجربة.
  2. تحديد موقع واحد C. ايليجانس المرحلة المطلوبة على لوحة NGM 18 (يرقات ذبابة الفاكهة أو الأولى من العمر اليرقي لوحة أجار أو البيض يدويا dechorionated الزرد HPF 30 اليرقات في وسط سائل 20) باستخدام المجهر ستيريو تضخم منخفضة. اختيار حيوان واحد باستخدام كمية صغيرة من محلول منظم في تلميح الصغيرة. خفض استخدام تلميح الصغيرة مع نهايته لاستيعاب أكبر ذبابة الفاكهة أو الزرد اليرقات في المخزن المؤقت.
  3. دفع الكائن الحي واحد من خلال تدفق مدخل القناة. ضبط ضغط pipetting لوضع الحيوان في فخ الفردية بموجب الرئيسي.
  4. زيادة الضغط للغشاء PDMS ببطء لوضع الحيوانات ضد تشاننيل الحدود مع شل والضغط PSI 14 للC. ايليجانس، 7 PSI لذبابة الفاكهة و 3 رطل ليرقات اسماك الزرد.
  5. وضع الحيوان يجمد في وسط الميدان المجهري للعرض. استخدام مجهر مقلوب في الإعدادات المطلوبة لحقل عالية الدقة مشرق أو التصوير مضان. الحصول على صور مضان واحد أو انقضاء الوقت، في إطار معدل معرفة مسبقا.
  6. الافراج عن الضغط فخ ورصد تحرك للحيوان لمدة 5-10 دقيقة في تضخم منخفضة.
  7. مطاردة الحيوان وإدراج حيوان جديدة لتكرار الخطوات المذكورة أعلاه.
  8. يغسل كل الحيوانات من الخزان النفايات باستخدام الماء المقطر تطبيقها باستخدام حقنة. تجفيف عن طريق دفع الهواء قناة باستخدام حقنة لإعادة استخدامها في المستقبل.

الاحتياطات: الحيوانات التي تتطلب الضغط العالي pipetting في التدفق داخل القناة الرئيسية تميل إلى إظهار تنقل الفقراء / الصحة بعد الإفراج من فخ ويجب تجنب لمعهد العالم العربيجينج. تنظيف قناة تدفق للأي أثر للعازلة لمنع انسداد القناة البلورات. إذا تم استخدام النفط لتصوير عالية الدقة، وتنظيف الزجاج لتغطية زلة تكون قادرة على الحفاظ على إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء للتجارب اللاحقة.

النتائج

الجهاز هو شل حركة كتلة PDMS طبقة ثنائية ملفقة من قبل الرابطة طبقتين: طبقة تدفق (طبقة 1) وطبقة التحكم (طبقة 2) كما هو موضح في الشكل 1. توصيل فخ الرئيسي لاسطوانة غاز النيتروجين من خلال تنظيم وقفة الديك 3-سيلة لتطبيق اللازمة (3-14 رطل) الضغط على الغشاء من خلال عمود السائل...

Discussion

PDMS الأجهزة ميكروفلويديك شفافة بصريا بالتالي يمكن استخدامها لتصوير بجودة عالية في الجسم الحي من أي كائن نموذج شفاف / شفافة. لدينا تصميم مناسب لتصوير عالية المكانية والزمانية التكبير من الأحداث الخلوية وشبه الخلوية في الحيوانات الحية سليمة. باستخدام تقنيات الطب?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور راي Krishanu للأسهم ذبابة الفاكهة، Tarjani أغاروال للحفاظ على قفص ذبابة الفاكهة، بيتر Juo لnuIs25 وCGC لC. ايليجانس السلالات. أدلى SPK jsIs609 في المختبر مايكل Nonet ل. نشكر آربان أجنيهوتري (BITS بيلاني) لمساعدته في الوقت الفاصل بين التصوير النقل الميتوكوندريا من الحيوانات jsIs609 في أجهزة ميكروفلويديك. ونحن ممتنون للدكتور براكاش Vatsala كرومالاي وSURYA لتزويدنا الأجنة الزرد. نشكر الدكتور كريشنا والمكاتب المركزية الوطنية في CIFF لاستخدام المجهر القرص الغزل مبائر بدعم من وزارة العلوم والتكنولوجيا مركز لتقنية النانو-(رقم SR/55/NM-36-2005). نشكر أيضا Kaustubh راو، فينكاترامان V. وSachidanand Chetana للمناقشات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة ما بعد الدكتوراه DBT (SM)، DST المسار السريع مخطط (SM) ومنحة لDBT (SPK). وأيد SA من المنح وDST CSIR لSPK.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
رقائق السيليكون جامعة رقاقة 150 مم (100) الصف الميكانيكية SSP سي
Clewin البرمجيات WieWeb البرمجيات الإصدار 2.90
الليزر الراسمة غرامة الخط التصوير 65024 DPI
HMDS سيغما الدريخ 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025، SU8-2050
المطور Microchem SU8 المطور
سيلاني سيغما الدريخ 448931-10G
PDMS داو كورنينج Sylgard 184
UV مصباح مشربية نافذة ناتئة 66943 200W الزئبق اوريل الخفيفة
فرن الهواء الساخن آلات فائقة والعرف وضعت في 50 ° C
لوحة الساخن IKA مختبر معدات 3810000 http://www.ika.com
البلازما الأنظف Harrick البلازما PDC-32G
الغزال نظم انتاج اشباه الموصلات SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
زجاج غطاء زلة الذهب خاتم 22 × 22 مم، سماكة رقم 1
C. ايليجانس Caenorhabditis علم الوراثة مركز (CGC) e1265، ayIs4
ذبابة الفاكهة بلومنجتون P {} chaGAL4 / cyo، UAS، syt.eGFP
الزرد نوع البرية الهندية نوع البرية
Tygon أنبوب سيجما Z279803
الدقيقة إبرة سيجما Z118044 مقطعة إلى قطع 1 سم
3-الطريقة محبس سيجما S7521
هاريس الناخس سيجما Z708631
مضغوط النيتروجين الغاز الغاز المورد المحلي استخدام منظم للسيطرة على ضغط
ستيريو المجهر نيكون SMZ645
مبائر المجهر ANDOR وأوليمبوس يوكوجاوا الغزل مبائر المجهر القرص
يماغيج المعاهد الوطنية للصحة www.rsbweb.nih.gov / ط جافا برنامج يستند معالجة الصور

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

67 microfluidics C synaptotagmin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved