播散性念珠菌在斑马鱼幼虫的非侵入性成像

摘要

斑马鱼的快速发展，小尺寸和透明度是先天感染的免疫控制的研究的巨大优势 ^1-4。在这里，我们证明斑马鱼幼虫病原真菌感染的技术白念珠菌通过显微注射方法最近使用的牵连吞噬细胞NADPH氧化酶活性真菌异形控制 ⁵。

摘要

由病原体白念珠菌引起的播散性念珠菌是临床上重要的问题，在住院的个人和30到40％的占死亡率^6。系统性念珠菌通常是由先天免疫控制，并与先天免疫细胞成分如巨噬细胞NADPH氧化酶的遗传缺陷的人更易患念珠菌^7-9。很少有人知道关于C 的动态白念珠菌与先天免疫细胞在体内的相互作用。在体外研究中广泛建立了外部主机C.白念珠菌的巨噬细胞内发芽，迅速 ​​摧毁了嗜中性粒细胞^10-14。 在体外研究中，虽然有用，能不能概括在复杂的体内环境，细胞因子水平，细胞外基质的附件，以及¹⁰间的接触，其中包括随时间变化的动态^{， 15-18} 斑马鱼幼虫提供了一个独特的和多功能的脊椎动物宿主感染的研究。发展的斑马鱼幼虫的前30天，有先天免疫防御^2，19-21，简化，如播散性念珠菌是高度依赖先天免疫疾病的研究。小斑马鱼幼虫的大小和透明度，使在细胞水平上的主机和病原体感染的动态影像。与先天免疫细胞荧光的转基因幼虫可用于识别特定的细胞类型涉及在感染^22-24。修饰的反义寡核苷酸（吗啉代）可以用来击倒各种免疫成分，如巨噬细胞NADPH氧化酶研究在回应funga的变化L型感染^5。除了使用小低脊椎动物的道德和实用性强等优点，斑马鱼幼虫提供了独特的图像之间的病原体和宿主在intravitally颜色的酣战的可能性。

斑马鱼已被用于模型感染人类致病细菌的数量，并一直在我们理解分枝杆菌感染^，25器乐重大进展。然而，最近才具有更大的病原体，如被用于真菌感染的幼虫^{5，23，26，}迄今没有发生过感染的方法进行了详细的视觉描述。在这里，我们提出后脑普里姆²⁵斑马鱼心室显微注射，包括我们以前的协议的修改我们的技术。 在体外研究中我们发现真菌感染的幼虫斑马鱼模型偏离和加强需要检查主机的病原体INTERAction培养皿⁵简化了系统的主机，而不是在复杂的环境中。

研究方案

所有斑马鱼的护理协议和实验机构动物照顾及使用委员会（IACUC）协议A2009-11-01下进行。

1。吗啉和幼虫注射菜

实验时间：*（10-15分钟）

难度：*

1. 对于鸡蛋打针，准备在无菌水和微波的2％的琼脂糖溶液。当溶液冷却，倒入了一些额外的深培养皿（Fisher Scientific则），直到它是半满。酷冰，确保板是水平。
2. 菜一旦冷却，倒入15毫升的2％琼脂糖顶层。喷一个鸡蛋从一个喷雾瓶的无菌水注入沟槽的塑料模具（自适应科学工具）。小心地将模具槽侧成热的琼脂糖。当琼脂糖冷却后，用金属扁铲（VWR科学）游离阿加模具上升。慢慢地消除从琼脂糖电网。封口膜裹胚胎注射菜（VWR科学）和存储倒在4°C
3. 对于鱼类幼体注射，准备了2％琼脂糖溶液。倒入一个标准大小的培养皿（VWR科学）解决方案，并拨出，直到它凝固。保鲜膜封口膜和商店在幼虫注射菜倒在4°C

2。真菌培养制备

实验时间：**（30分钟）

难度：**

1. 准备酵母提取物，蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板：10克/升的酵母提取物，20克/升蛋白胨20克/升，葡萄糖，20克/升的琼脂和釜。为准备的YPD液体10克/升的酵母提取物，20克/升蛋白胨20克/升葡萄糖121和高压灭菌20-30分钟°C。
2. 冷冻鱼感染前两天准备的条纹板白念珠菌文化上的YPD琼脂股票获得单菌落。
3. 孵育37℃过夜。
4. 5毫升的YPD肉汤放入16 x 150毫米文化管（VWR科学）。
5. 鱼感染前一天挑上用木榫（VWR科学）的YPD琼脂1小殖民地。把文化管和漩涡，周围重新挂起殖民地的YPD液体棒。
6. 生长在37°C配备一台14英寸的试管轮（新不伦瑞克省科学）上的TC-7组织文化辊鼓过夜。
7. 第二天，降速在14000xĞ为1.7毫升管（爱思进）1分钟1毫升的文化。取出上清液，残留液体中悬浮颗粒由涡旋（VWR科学）。
8. 加入1 mL 1X的磷酸盐缓冲液（VWR科学）和旋转如前所述。
9. 重复PBS洗3次。
10. 在1X PBS稀释1:100稀释液（10μL到990μL1X P级水洗白念珠菌BS）
11. 在血球（VWR科学）计数。
12. 稀释至10 ⁷细胞/ ml。

3。斑马鱼感染

实验时间：****（1-3小时）

难度：****

1. 根据第5条和蛋水店，60 mg / L的无菌去离子水瞬间海洋盐（Fisher Scientific则）收集胚胎。
2. 使用，如奥林巴斯SZ61（奥林巴斯），感染当天dechorionate胚胎解剖显微镜。使用杜蒙Dumoxel镊子（VWR科学）拉，就像打开一包薯条，或轻轻捅到闭合位置的绒毛镊子，然后慢慢地打开它们的绒毛²⁷分开。鱼应该弹出出的绒毛。
3. 旋流超深培养皿盖子，将鱼入盘的中心。鱼转移到盖子的菜。卸下鸡蛋，水和与新媒体取代。添加鱼类媒体。
4. 温暖的幼虫在孵化器注射菜在28°C。准备tricaine甲烷磺酸（西方化学公司）稀释在200微克/毫升麻醉鱼。
5. 计算出所需数量的幼虫感染（20-50鱼）。把鱼在tricaine甲烷磺酸盐溶液，等待1-2分钟，直到他们停止移动。
6. 打开移动电话伙伴关系-3注射装置（应用科学仪器）。确保压力开关是“脉冲”和“脉冲宽度”设置3 PSI背压机组9。氮气罐阀门打开，直到注射单元上的压力读数为30 PSI。
7. 5μL涡旋念珠菌，1×10 ⁷细胞/毫升的浓度，装入一把拉住微量^28。将微量的微量持有人（应用科学仪器）。装满水的超深空培养皿。移动，直到尖端的微量我只是在视图通过解剖显微镜和使用，杜蒙Dumoxel镊子（VWR科学）夹针拔出吸管尖3毫米接触水面。
8. 按下脚踏开关（应用科学仪器）来验证针已被截断。你应该看到的液体分散，如果你是成功的。液体丸的直径应不超过整洁²⁵斑马鱼幼虫的瞳孔直径（0.21毫米，产生球体体积的4.9 NL）大。调整的压力，相应地，如果液体丸是太大或太小。
9. 麻醉在tricaine甲烷磺酸的鱼（200微克/毫升）。一旦鱼已停止移动，漩涡，直至鱼在中心与盖菜。收集50个鱼用移液管（Fisher Scientific则）。点击移液器解决对尖鱼的一面。到幼虫琼脂糖菜用尽可能少的液体轻轻吸取鱼。
10. 线鱼，具有光滑的玻璃棒（小心不粉碎他们！）。吸菜可能关闭的液体。使用KimWipe灯芯了任何水分。
11. 直到你得到一个好鱼和针同时认为，放置在显微镜下的仔鱼琼脂糖菜。迈向鱼的玻璃针。在鱼和针定位针对鱼变焦。小心移动到耳泡^{27，29（EAR）}的第一条鱼的玻璃针。你就会知道，一旦你已经搬进针鱼，因为当你把脚踏开关（应用科学仪器），后脑心室将解除略有上升。
12. 按下脚踏开关（应用科学仪器），并观看鱼的后脑脑室²⁷内液体分散。收回针从鱼和移动到下一个鱼。重复步骤，直到您已注入盘上所有的鱼。删除任何D的EAD鱼和注入更换，以保持正确的数量（50鱼）。对于每个组50鱼注入了新的显微注射针必须做好准备，或三白色念珠菌在平息针的底部和木屐，或引发的浓度注射。
13. 洗净的菜鱼钓鱼菜和干净的超深Petri含有60毫升水蛋菜蛋水喷洒到鱼。重要的是不要离开琼脂糖鱼长于15-20分钟，或他们会干死。
14. 重复直到完成整个注塑过程。不要忘了PBS和非致病性注入控制。
15. 当完成后，保持在28鱼°C。
16. 关闭氮气罐阀门。注射装置的开关从“脉冲”移动“连续”，以纾缓在油箱管路压力，压力应该下降到零，在这一点上。注射装置切换回“把脉”。注射装置关闭和清理工作区。

4。准备成像鱼

实验时间：**（30分钟）

难度：**

1. 前（200微克/毫升）准备tricaine甲烷磺酸的解决方案。走出被感染的鱼，转移到tricaine。
2. 准备鸡蛋水47.9 mL 0.4％的低熔点琼脂糖（VWR科学）。通过微波加热解决方案。冷却到37°C和附加tricaine甲烷磺酸盐（200微克/毫升）的混合物
3. 一旦鱼被固定在tricaine甲烷磺酸，吸管到培养皿中含有0.4％的低熔点琼脂糖（VWR科学）（VWR科学）鱼个体。
4. 其次，从低熔点琼脂糖移动到单井成像（MatTek公司）的玻璃底菜的鱼。使用尽可能使鱼平放在盘子的底部在于尽可能少的低熔点琼脂糖。仅使用足够的tricaine琼脂糖填补玻璃底菜NER界。

5。朱庇特议定书有关的修改

微电极用于显微注射

实验时间：*（10-15分钟）

难度：*

1. 拉中空玻璃棒BF120-69-10（萨特仪器）使用火焰布朗微管普勒的P-97型（萨特仪器）根据元等^30。选择具备下列条件的热量= 470，速度= 120，时间= 200计划＃7。由此产生的针是8毫米，从伞给小费，一旦夹在3毫米以上的小费，它有一个直径约为10微米。
2. 装入括号玻璃微。选择“拉”。加热丝将按照程序参数和玻璃棒将分成两个拉微电极针加热。在吸管储物盒（Sutt商店微电极呃文书）。

胚胎收集，吗啉注射液和维护

实验时间：***（1-2小时）

难度：***

3. 根据Rosen 等³¹的方法，收集胚胎。使用塑料筛（诺士洁具）收集鸡蛋从产卵池（水生境）。举行筛倒挂一个额外的深培养皿和冲洗水箱，收集鸡蛋。
4. 吗啉的制备，添加300μL无菌水300纳摩尔啉（GeneTools，有限责任公司）的。这给出了一个1.0毫米的股票。
5. 验证使用的NanoDrop（Thermo Scientific的）吗啉的浓度。选择“核酸和改变的样本类型为”其他“，波长为265。输入常数乘以吗啉1000分子量absorptivit分为Ÿ系数吗啉代寡核苷酸的属性表中列出。
6. 空白的NanoDrop 2μL，0.1 N的盐酸。稀释5μL吗啉溶液将达到0.1 N盐酸（20倍稀释）95μL。将2μL稀释的NanoDrop基座和点击的措施。乘以稀释倍数（20）的浓度。这给出了一个工作啉浓度。计算毫摩尔浓度的划分由获得分子量的吗啉的浓度。
7. 准备工作的Danieau啉在缓冲区（氯化钠58毫米，0.7毫米氯化钾， _硫酸镁 0.4毫米，0.6毫米的Ca（NO _3）2，5.0毫米肝素钠，pH值7.6）和0.01％酚红（VWR科学）股票。
8. 啉注射工作，按照协议，根据Rosen 等³¹元等^30。冲洗啉注射液的菜肴，在28°C，15分钟，鸡蛋，水和温暖。从注射菜肴和线一个-C水成菜用移液管注射（从第1条编制）的凹槽的ELL阶段的胚胎。每块板将容纳大约250个鸡蛋。 1-2细胞阶段的胚胎注入啉。鸡蛋将保持在15分钟²⁷的单细胞阶段。
9. 在60毫升的额外深培养皿中蛋水冲洗注入蛋与蛋水结束时（60 mg / L的即时海洋盐无菌去离子水）和地点。可以重复使用吗啉注射菜。蛋水冲洗结束时，并储存在4°C倒置
10. 对于存储添加60毫升水蛋抛出胚胎。算出来成单独的超深培养皿110胚胎蛋水60毫升，用移液管。添加0.00003％亚甲蓝，以防止微生物的生长和孵化的胚胎，在28°C。
11. 要加快胚胎的发育，保持在33°C 24小时和阶段的胚胎菜肴根据金梅尔等^27，让胚胎发展到头部主干角度75°（PRIM 25阶段^27）。
12. 幼虫感染工作，保持在28°C 与 C注射后的胚胎白色念珠菌。
13. 每天60毫升新鲜鸡蛋水代替胚胎菜肴。

成像

实验时间：*****（1-5小时）

难度：***

14. 准备在低熔点琼脂糖（4.2节），如前面所述，在玻璃底部的成像菜（MatTek公司）tricaine鱼。奥林巴斯IX-81（奥林巴斯）倒置显微镜放在菜。微分干涉对比（DIC）的光下，带来4倍放大倍率下的鱼成焦点。图像可以被捕获的4倍，20倍，并在DIC，TRITC（四甲基若丹明异硫氰酸）和FITC（异硫氰酸荧光素）的过滤器设置，40倍的放大倍率。
15. 使用FV-1奥林巴斯IX-81倒置显微镜000激光扫描共聚焦系统有贺等^32。进行40倍放大倍率的时间课程设置Z轴堆叠1-1.5微米片每隔一小时感染。
16. 2个小时或更长时间当然成像，放置在顶部的在成像菜鱼每隔2-3小时的低熔点琼脂糖层。这可以防止干燥和粉碎的鱼，而它正在成像琼脂糖。对于一个小的鱼数量的漫长时间的课程，使用了激烈的阶段（Bioptechs公司）保持在29°C感染。

6。代表结果

例如一个成功的后脑脑室C.白色念珠菌感染，在斑马鱼幼虫在5小时后感染（HPI）和24 HPI所示（ 图1）。巨噬细胞样细胞，吞噬C。白念珠菌被认为是在5 HPI的后脑心室。 24 HPI，C.白色念珠菌是内巨噬细胞样细胞S在背尾组织的播散性念珠菌指示。这种感染的结果是高度依赖10-15 C.酵母形式的准确注射后白念珠菌到后脑心室。被感染的鱼立即注射后的筛选，可以确保这一点。

图1转基因FLI1：绿色荧光蛋白^22，氟化钙，yCherry 白念珠菌和共聚焦显微镜成像intravitally ³³幼虫感染。 （AC）5小时后感染（一）-EGFP表达巨噬细胞样细胞在感染部位（后脑心室）比例尺= 100微米的感染幼虫。 （B和C）高倍率图像相同的鱼，显示C。白色念珠菌在吞噬。比例尺= 100微米和10微米为C.（DF）的氟化钙，yCherry C.传播与念珠菌感染后24小时（D）与被感染的幼虫白念珠菌内EGFP的MAC在背尾组织的巨噬细胞的细胞。比例尺= 100微米。 （E和F）高倍率图像相同的鱼，显示C。白色念珠菌在尾部组织。比例尺= 100微米。

讨论

这里的斑马鱼显微注射的方法不同于，Gutzman 等。在这里³⁴我们展示通过注射到36至48 HPF幼虫的后脑心室耳泡。我们所描述的方法可以减少组织损伤后脑心室10-15酵母一致的注入。该协议产生的最初24 HPI（ 图1）造成重大杀伤力/ ⁵发病，整个身体蔓延的局部感染。后脑脑室不完全封闭，直到48 HPF ^27，29。在此发展的巨噬细胞和中性粒细胞的早期迁移到感染?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
产卵箱	水生栖息地	2L
1.7 mL管	爱思进	MCT-175-C的
即时海洋	Fisher Scientific则	S17957C
超深培养皿	Fisher Scientific则	08-757-11Z
标准的培养皿	厂商VWR科学	25384-302
转移移液器	Fisher Scientific则	13-711-7M
酵母提取物	厂商VWR。科学家FIC	90000-726
蛋白胨	厂商VWR科学	90000-264
葡萄糖	Fisher Scientific则	D16-1
洋菜	厂商VWR科学	90000-760
一次性血球	厂商VWR科学	82030-468
磷酸盐缓冲液	厂商VWR科学	12001-986
杜蒙Dumoxel镊子	厂商VWR科学	100501-806
木销钉	厂商VWR科学	10805-018
KimWipes	厂商VWR科学	300053-964
低熔琼脂糖	厂商VWR科学	12001-722
琼脂糖为注射菜	厂商VWR科学	12002-102
火焰山布朗微管普勒	萨特仪器	的P-97
中空玻璃棒	萨特仪器	BF120-69-10	对于光滑的玻璃玻璃棒本生灯加热
吸取存储盒	萨特仪器	BX10
MPPI-3喷射系统	应用科学仪器	移动电话伙伴关系-3
背压单位	应用科学仪器	边境巡逻队
微量持有人套件	APPLIED科学仪器	MPIP
脚踏开关	应用科学仪器	搅拌摩擦焊
微操作机器人	应用科学仪器	MM33
磁性底座	应用科学仪器	磁性底座
tricaine甲烷磺酸盐	西方化工公司	MS-222
解剖范围	奥林巴斯	SZ61顶端SZX-ILLB2-100基地
共聚焦显微镜	奥林巴斯	IX-81 FV-1000激光扫描共聚焦系统
TC-7组织文化与14英寸试管轮辊筒	新不伦瑞克省科技	TC-7
成像菜	MatTek公司	P24G-1.0-10 - F
用于装载针枪头	Eppendorf公司	930001007
板浇筑电网	自适应科学工具	TU-1
加热阶段	bioptechs公司	三角洲T-5
扁铲	厂商VWR科学	82027-486
塑料分子筛	制品的诺士佛在线	12厘米
封口膜	厂商VWR科学	52858-000
涡精灵	厂商VWR科学	14216-184
16 x 150毫米的文化管	厂商VWR科学	60825-435
的NanoDrop	Thermo Scientific的	ND折价2000
酚红	厂商VWR科学	97062-478
盐酸	厂商VWR科学	87003-216
氯化钠	厂商VWR科学	BDH4534-500GP
氯化钾	厂商VWR科学	BDH4532-500GP
硫酸镁	厂商VWR科学	BDH0246-500GP
的Ca（NO 3）2	厂商VWR科学	BDH0226-500GP
肝素钠	厂商VWR科学	BDH4520-500GP
吗啉代	GeneTools，LLC