Неинвазивная визуализация диссеминированный кандидоз в Личинки данио рерио

Резюме

Бурное развитие, малый размер и прозрачность данио огромные преимущества для изучения иммунной контроль инфекции ^1-4. Здесь мы покажем методы заражения личинки данио использованием возбудителей грибковых Candida Albicans По микроинъекции, методология недавно использовали, чтобы обвинить фагоцитарную активность NADPH оксидазы в управлении грибковых диморфизм ⁵.

Аннотация

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality⁶. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia^7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils^10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts^{10, 15-18}. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host.

The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses^{2, 19-21}, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection^22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection⁵. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color.

The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection^{3, 25}. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva^{5, 23, 26}, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim²⁵ zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish⁵.

протокол

Все данио протоколы ухода и эксперименты проводились в условиях институционального ухода и использования животных комитета (IACUC) протокол A2009-11-01.

1. Морфолино и личинок посуды инъекций

Экспериментальные продолжительность: * (10-15 минут)

Степень сложности: *

1. Для инъекций яйца, готовят 2% агарозном решение в стерильной водой и микроволновая печь. Когда раствор остынет налить его в дополнительные глубокие чашки Петри (Fisher Scientific), пока он наполовину полон. Прохладный на лед и убедитесь, что пластины уровне.
2. Когда блюдо остынет, залить 15 мл верхнего слоя 2% агарозы. Спрей яйцо инъекции канавками для литья пластмасс (адаптивная науки Tools) стерильной водой из пульверизатора. Аккуратно положите форму паз вниз в горячую агарозы. Когда агарозном остынет, используйте плоский металлический шпатель (VWR Scientific) отделить форму от агарозу. Медленно снимите сетку из агарозы. Перенос эмбрионов инъекции блюда в парафильмом (VWR Scientific) и перевернутый магазин при 4 ° C.
3. Для инъекций рыб личиночные, готовят 2% агарозном решение, как описано. Залейте раствор в стандартный размер чашки Петри (VWR Scientific) и отложите в сторону, пока он не затвердеет. Wrap личиночной блюда инъекций в парафильмом и хранить перевернутой при 4 ° C.

2. Грибковые Подготовка культуры

Экспериментальные продолжительность: ** (30 минут)

Степень сложности: **

1. Подготовить дрожжевой экстракт, пептон-декстроза (YPD) агаром: 10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л, глюкоза, 20 г / л агара и в автоклаве. Для подготовки YPD жидкости 10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л, глюкоза и автоклава 20-30 минут при температуре 121 ° C.
2. За два дня до рыбы инфекции подготовить серию пластин из замороженногозапасы Candida Albicans культур на YPD агар для получения отдельных колоний.
3. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
4. Положите 5 мл бульона YPD в 16 х 150 мм культуры труб (VWR Scientific).
5. За день до рыбы инфекции выбрать 1 небольшой колонии на агаре с YPD деревянные дюбеля (VWR Scientific). Вставьте карту в трубку культуры и вертеться вокруг повторно приостанавливать колонии в YPD жидкости.
6. Расти в течение ночи при 37 ° C на ТС-7 тканей барабан культуры роликовые оснащен 14-дюймовым пробирке колеса (New Brunswick Scientific).
7. На следующий день, замедления вращения 1 мл культуры в г 14000x в течение 1 минуты в 1,7 мл трубки (Axygen). Удалить супернатант и осадок ресуспендируют в остаточной жидкости встряхивая (VWR Scientific).
8. Добавить 1 мл 1x фосфатного буфера (VWR Scientific) и спина, как описано выше.
9. Повторите мытье PBS 3 раза.
10. Развести в разведении 1:100 1x PBS (10 мкл промытый C. Albicans в 990 мкл 1x PБС).
11. Рассчитывать на гемоцитометра (VWR Scientific).
12. Развести в 10 ⁷ клеток / мл.

3. Данио рерио инфекции

Экспериментальные продолжительность: **** (1-3 часов)

Степень сложности: ****

1. Сбор эмбрионов в соответствии с разделом 5 и магазин в яйцо воды, 60 мг / л солей мгновение океан (Fisher Scientific) в стерильной дистиллированной водой.
2. Используя микроскоп рассечения, таких как Olympus SZ61 (Olympus), dechorionate эмбрионов на инфекцию день. Используйте пинцет Dumoxel Дюмон (VWR Scientific) тянуть хориона ^27, кроме как открыть пакетик чипсов или слегка ткнуть пинцетом в закрытом положении в хориона, а затем медленно откройте их. Рыба должна появиться прямо из хориона.
3. Swirl дополнительные глубокие чашки Петри с крышкой, чтобы переместить рыбу в центр блюда. Передача рыб крышку блюдо. Удалите яйца и водызаменить свежей информации. Добавить рыбу СМИ.
4. Теплые блюда личиночной инъекции в термостате при 28 ° C. Подготовить tricaine метан сульфонат (Западная Химическая Inc) в разведении 200 мкг / мл для обезболивающего рыбу.
5. Отсчитывать нужное количество личинок-инфекции (20-50 рыб). Положите рыбу в tricaine решение сульфонат метана и подождать 1-2 минуты, пока они не перестают двигаться.
6. Включите ИПМТ-3 узла впрыска (прикладных научных приборов). Убедитесь, что реле давления на "импульс" и "длительность" установлен до 9 с 3 PSI для противодавление устройства. Откройте клапан бака азота до давления впрыска читает 30 PSI.
7. Загрузка вытащил микропипетки ²⁸ с 5 мкл встряхивали Candida Albicans в концентрации 1х10 ⁷ клеток / мл. Поместите микропипетки в держатель пипетки (прикладных научных приборов). Заполнить пустые дополнительные глубокие чашки Петри с водой. Перемещение микропипетки до кончика яс в поле зрения лишь касаясь поверхности воды с помощью рассечения микроскоп и использование Дюмон Dumoxel пинцет (VWR Scientific), чтобы обрезать иглы около 3 мм от кончика пипетки вытащил.
8. Нажмите на педаль (прикладных научных инструментов), чтобы убедиться иглы был обрезан. Вы должны увидеть жидкой дисперсной если бы вы были успешными. Диаметр жидкости болюсно должна быть не больше, чем диаметр зрачка чопорной ²⁵ данио личинка (0,21 мм, что дает сфера 4,9 нл по объему). Отрегулируйте давление соответственно, если жидкости болюсно является слишком большим или слишком маленьким.
9. Обезболить рыбу в сульфонат метана tricaine (200 мкг / мл). Как только рыба остановилась, вихревые блюдо с крышкой, пока рыба в центре. Соберите 50 рыб с помощью передачи пипетки (Fisher Scientific). Нажмите на стороне пипеткой по урегулированию рыбы к концу. Осторожно пипетировать рыбу на блюдо личиночной агарозы, используя в качестве немного жидкости, как это возможно.
10. Линия рыбу с гладкой стеклянной палочкой (будьте осторожны, чтобы не раздавить их!). Аспирируйте столько жидкости, возможно от этого блюда. Используйте KimWipe на фитиль от влаги.
11. Установите личиночной блюдо с рыбой агарозном под микроскопом, пока не получите хороший вид рыбы и иглы в то же время. Перемещение стекла иглы к рыбе. Увеличить как на рыбу и иглы, как вы установите иглу к рыбе. Тщательно перемещать иглу в стекло слухового пузырька ^{27, 29} (ухо) первой рыбы. Вы будете знать только вы переехали иглу в рыбе, потому что когда вы нажимаете на педаль (прикладных научных приборов), задний мозг желудочка поднимет немного.
12. Нажмите на педаль (прикладных научных приборов) и смотреть жидкой дисперсной внутри задний мозг рыбы желудочка ^27. Уберите иглу из рыбы и перейти к следующей рыбы. Повторяйте процедуру, пока не вводится вся рыба на тарелке. Удалите гРыба EAD и ввести замену, чтобы число правильных (50 рыб). Для каждой группы из 50 рыб вводят новую иглу микроинъекции должны быть готовы, или C. Albicans располагается в нижней части иглы и забивает он, или сбрасывает концентрации инъекции.
13. Промыть рыбу от этого блюда на рыбалку блюдо и опрыскивания яиц воды на рыбу в чистой дополнительные глубокие чашки Петри, содержащие 60 мл яйцо воды. Важно не оставлять рыбу на агарозном более чем на 15-20 минут, иначе они высыхают и умирают.
14. Повторите весь процесс инъекции пока не закончено. Не забывайте, PBS и непатогенных вводят контроль.
15. Когда закончите, держать рыбу на 28 ° C.
16. Закройте клапан азота танка. Переместите переключатель впрыска с "импульс" на "непрерывный", чтобы уменьшить давление в баке линии, давление должно снизиться до нуля в этой точке. Включите впрыска к «Пульс». Выключите впрыска и очистки рабочей зоны.

4. Подготовка рыбы для работы с изображениями

Экспериментальные продолжительность: ** (30 минут)

Степень сложности: **

1. Подготовить tricaine метан сульфонат решение как и раньше (200 мкг / мл). Убирайся зараженную рыбу, и передавать их в tricaine.
2. Подготовить 47,9 мл 0,4% легкоплавкой агарозы (VWR научных) в яйце воды. Нагрейте раствор микроволновой печи. Остудить до 37 ° С и добавить tricaine метан сульфонат (200 мкг / мл) в смеси
3. Как только рыба закреплены tricaine метан сульфонат, пипетки особи в чашку Петри (VWR научные), содержащий 0,4% низкой температурой плавления агарозы (VWR Scientific).
4. Затем переместить рыбу из низкой температурой плавления агарозы в отдельных скважинах блюдо со стеклянным дном (Маттек Corporation) для работы с изображениями. Используйте как можно меньше низкой температурой плавления агарозы как возможно, чтобы рыба лежит плоско на дне тарелки. Используйте только достаточно tricaine-агарозы, чтобы заполнить впартнера кругах блюдо со стеклянным дном.

5. Изменения, относящиеся к Юпитеру протоколы

Микропипетки для Микроинъекция

Экспериментальные продолжительность: * (10-15 минут)

Степень сложности: *

1. Потяните полые стержни стекло BF120-69-10 (Sutter Instruments) с помощью пипетки Горячие Браун Puller Модель P-97 (Sutter Instruments) в соответствии с Юань и соавт. ^30. Выберите программу № 7 со следующими условиями тепло = 470, скорость = 120, Время = 200. В результате иглы 8 мм с коническими к кончику и, когда обрезается на 3 мм выше кончика он имеет диаметр около 10 мкм.
2. Загрузка стекла микропипетки в скобках. Выберите "Pull". Отопления нить будет нагреваться иглу в соответствии с программой параметров и стеклянной палочкой будет разделиться на две вытащил микропипетки. Магазин микропипетки в окне пипетки хранения (Suttэ инструментов).

Эмбрион сбор, морфолино инъекций и обслуживание

Экспериментальные продолжительность: *** (1-2 часа)

Степень сложности: ***

3. Сбор эмбрионов в соответствии с методами Розен и др.. ^31. Использование пластиковых сито (Изделия Knutsford) собирать яйца из нерестовых бак (водной среды). Держа решето с ног на голову в течение дополнительных глубоких чашках Петри и промыть бак воды для сбора яиц.
4. Для приготовления морфолино, добавьте 300 мкл стерильной воды до 300 нмоль из морфолино (GeneTools, LLC). Это дает рабочие запасы 1,0 мм.
5. Проверьте концентрацию морфолино с помощью Nanodrop (Thermo Scientific). Выберите "нуклеиновой кислоты и изменить образец типа« другие »и длина волны до 265. Введите постоянного умножения молекулярный вес морфолино в 1000 разделен на absorptivitкоэффициент у, перечисленные в окне свойств морфолино олиго.
6. Пустые nanodrop с 2 мкл 0,1 N HCl. Развести 5 мкл раствора морфолино на 95 мкл 0,1 N HCl (20x разведения). Поместите 2 мкл разведения на nanodrop пьедестал и нажмите меры. Умножьте концентрации на коэффициент разведения (20). Это дает рабочие концентрации морфолино. Для расчета концентрации миллимолярных делить концентрацию получить молекулярный вес морфолино.
7. Подготовка рабочего запаса морфолино в Danieau буфера (58 мМ NaCl, 0,7 мМ KCl, 0,4 мМ MgSO _4, 0,6 мМ Ca (NO _{3) 2,} 5,0 мМ HEPES, рН 7,6) и 0,01% фенола красного (VWR Scientific).
8. Для работы инъекции морфолино следовать протоколу в соответствии с Розен и др. ^31. И Юань и соавт. ^30. Промыть блюда морфолино инъекции яйца водой и теплом при 28 ° С в течение 15 минут. Удаление воды из инъекция блюда и состав одного слокоть стадии эмбриона в пазы инъекции блюдо (готовится из раздела 1) с передачей пипетки. Каждая пластинка будет содержать около 250 яиц. Вводите 1-2 эмбрионов клетки сцене с морфолино. Яйца остаются в одном-клеточной стадии в течение 15 минут ^27.
9. Промыть вводят яйца с яйцами воды после завершения (стерильный деионизированной воды 60 мг / л солей мгновенных океан) и место в 60 мл воды яйцо в дополнительных глубоких чашках Петри. Блюда морфолино инъекции могут быть использованы повторно. Промойте яйца водой, когда закончил и сохраняет инвертируется при 4 ° C.
10. Для хранения эмбрионов добавить 60 мл воды яйца на блюдо. Граф из 110 эмбрионов с передачей пипеткой в ​​отдельные дополнительные глубокие чашки Петри с 60 мл яйцо воды. Добавить 0,00003% метиленовым синим, чтобы предотвратить рост микроорганизмов и инкубировать эмбрионов при 28 ° C.
11. Чтобы ускорить развитие эмбриона сохранить эмбрион блюд на 33 ° С в течение 24 часов и в зависимости от стадии Kimmel и соавт. ^27, позволяющий эмбрионы развиваются в головуствол углом 75 ° (Прим 25 этап ^27).
12. В личиночной работы инфекции держать эмбрионов при 28 ° С после инъекции C. Albicans.
13. Каждый день заменить эмбрион блюда с 60 мл свежего яйца водой.

Изображений

Экспериментальные Продолжительность: ***** (1-5 часов)

Степень сложности: ***

14. Подготовить рыбу в низкой температурой плавления агарозы (в соответствии с разделом 4.2) с tricaine в стеклянным дном изображения блюд (Маттек Corporation), как описано выше. Поместите блюдо на Olympus IX-81 (Olympus), перевернутый столик микроскопа. Принесите рыбу в центр внимания при 4x увеличение относительно дифференциальных интерференционного контраста (DIC) света. Изображения могут быть записаны на скорости 4х, 20х и 40х увеличением в ОПК, TRITC (тетраметил изотиоцианат родамин) и FITC (флуоресцеин изотиоцианат) настройки фильтра.
15. Используйте Olympus IX-81 инвертированный микроскоп с FV-1000 лазерной сканирующей конфокальной системы в соответствии с Ariga соавт. ^32. Проводить время на курсах 40-кратном увеличении, установив Z-стеки с 1-1,5 мкм ломтиками каждый час инфекции.
16. Долгое время изображение курс 2 часа или больше, поместите слой низкой температурой плавления агарозы в верхней части рыбы в блюде изображения каждые 2-3 часа. Это предотвращает агарозном от высыхания и измельчения рыбы во время ее образ. Для длительных курсах время с небольшим количеством рыбы, использование нагретого этапе (Bioptechs Inc) для поддержания 28 ° C в течение инфекции.

6. Представитель Результаты

Примером успешного задний мозг желудочка C. Albicans инфекции у данио личинка в 5 часов после заражения (ИНН) и 24 HPI показано на (рис. 1). Макрофаги, как клетки охватили C. Albicans видны в задний мозг желудочка на 5 HPI. К 24 HPI, C. Albicans внутри макрофагов, как сотовыес в спинной ткани хвоста указывает на диссеминированный кандидоз. Эта инфекция результат во многом зависит от точного введения 10-15 дрожжи форме C. Albicans в задний мозг желудочка. Скрининг зараженную рыбу сразу же после инъекции можете убедиться в этом.


Рисунок 1 Трансгенные fli1. EGFP ^{22, 33} личинок, инфицированных CAF2-yCherry Candida Albicans и отображаемого intravitally с помощью конфокальной микроскопии. (AC) 5 часов после заражения (А) Инфицированные личинки с экспрессией EGFP макрофаг-подобных клеток в месте инфекции (задний мозг желудочка) Шкала бар = 100 мкм. (B и C) Высшее увеличения изображения одного и того же рыба, показывая C. Albicans в фагоцитов. Шкала бар = 100 мкм для B и 10 мкм для С. (DF) 24 часа после заражения (D) Инфицированные личинки с диссеминированный кандидоз с CaF2-yCherry C. Albicans в EGFP Macrophage-подобных клеток в спинной ткани хвоста. Шкала бар = 100 мкм. (E и F) Высшее увеличения изображения одного и того же рыба, показывая C. Albicans в хвост ткани. Шкала бар = 100 мкм.

Обсуждение

Данио методом микроинъекции, представленные здесь отличается от Gutzman и др. ^34. В том, что здесь мы демонстрируем инъекции через слуховым пузырьком в задний мозг желудочка 36 до 48 личинок HPF. Метод описан позволяет последовательное введение 10-15 дрожжи в задний мозг желудочка с ум?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (опционально)
Нерест танков	Водной среды обитания	2L
1,7 мл труб	Axygen	MCT-175-C
Мгновенный океана	Fisher Scientific	S17957C
Дополнительные глубокие чашки Петри	Fisher Scientific	08-757-11Z
Стандартные чашки Петри	VWR Научные	25384-302
Передача пипетки	Fisher Scientific	13-711-7М
Дрожжевой экстракт	VWR ScientiFIC	90000-726
Пептон	VWR Научные	90000-264
Декстроза	Fisher Scientific	D16-1
Агар	VWR Научные	90000-760
Одноразовые гемоцитометра	VWR Научные	82030-468
Фосфатного буфера	VWR Научные	12001-986
Дюмон Dumoxel пинцет	VWR Научные	100501-806
Деревянные дюбели	VWR Научные	10805-018
KimWipes	VWR Научные	300053-964
Низкой температурой плавленияАгароза	VWR Научные	12001-722
Агарозы для инъекций блюда	VWR Научные	12002-102
Горячие Браун микропипетки Puller	Саттер инструменты	P-97
Полые стержни стекло	Саттер инструменты	BF120-69-10	Для стеклянных стержней гладкого стекла при нагревании свыше Горелка Бунзена
Внесите Коробка для хранения	Саттер инструменты	BX10
ИПМТ-3 Система впрыска	Прикладные научного приборостроения	ИПМТ-3
Вернуться удельное давление	Прикладные научного приборостроения	ГПП
Микропипетки держатель комплект	Appliиздание научного приборостроения	MPIP
Foot Switch	Прикладные научного приборостроения	FSW
Микроманипулятор	Прикладные научного приборостроения	MM33
Магнитная база	Прикладные научного приборостроения	Магнитная база
Tricaine метан сульфонат	Западные химических Инк	MS-222
Анатомический Область	Олимп	SZ61 верхней SZX-ILLB2-100 база
Конфокальной микроскопии	Олимп	IX-81 с FV-1000 конфокальной лазерной сканирующей системы
ТС-7 тканевой культуры каток с 14-дюймовыми колесными пробирки	New Brunswick Scientific	ТС-7
Изображениями посуды	Маттек корпорации	P24G-1.0-10-F
Наконечники для загрузки иглы	Эппендорф	930001007
Пластина заливки сетки	Адаптивная науки Инструменты	Ту-1
Подогрев этап	Bioptechs Инк	Delta T-5
Плоский шпатель	VWR Научные	82027-486
Пластиковые Сита	Изделия Knutsford Интернет	12 см
Парафильмом	VWR Научные	52858-000
Vortex Genie	VWR Научные	14216-184
16 х 150 мм трубы культуры	VWR Научные	60825-435
Nanodrop	Thermo Scientific	ND 2000
Фенол красный	VWR Научные	97062-478
HCl	VWR Научные	87003-216
NaCl	VWR Научные	BDH4534-500gP
KCl	VWR Научные	BDH4532-500gP
MgSO 4	VWR Научные	BDH0246-500gP
Ca (NO 3) 2	VWR Научные	BDH0226-500gP
HEPES	VWR Научные	BDH4520-500gP
Morpholinos	GeneTools, ООО