Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Riepilogo

Il rapido sviluppo, di piccola dimensione e la trasparenza delle zebrafish sono vantaggi enormi per lo studio del sistema immunitario innato il controllo delle infezioni ^1-4. Qui mostriamo le tecniche per infettare le larve di zebrafish con il patogeno fungino Candida albicans Con microiniezione, la metodologia recentemente utilizzata per coinvolgere fagocita l'attività NADPH ossidasi nel controllo del dimorfismo fungino ⁵.

Abstract

Candidiasi disseminata causata dal patogeno Candida albicans è un problema importante negli individui clinicamente ospedalizzati e viene associato ad una mortalità 30 al 40% attribuibile ^6. Candidosi sistemica è normalmente controllata da immunità innata, e gli individui con difetti genetici in cellule immunitarie innate componenti come NADPH ossidasi dei fagociti sono più sensibili alla candidemia ^7-9. Molto poco si sa circa la dinamica di C. l'interazione con le innate albicans cellule immunitarie in vivo. Ampia studi in vitro hanno stabilito che al di fuori dello Stato membro ospitante C. albicans germina all'interno dei macrofagi, ed è rapidamente distrutto da neutrofili ^10-14. Gli studi in vitro, anche se utile, non può ricapitolare il complesso in un ambiente vivo, che include dipendenti dal tempo la dinamica dei livelli di citochine, gli allegati della matrice extracellulare, e contatti intercellulari ^{10, 15-18} La larva zebrafish offre un ospite vertebrato unico e versatile per lo studio di infezione. Per i primi 30 giorni di larve di sviluppo zebrafish hanno solo le difese immunitarie innate ^{2, 19-21,} semplificando lo studio di malattie come la candidosi disseminata, che sono altamente dipendenti sull'immunità innata. Le dimensioni ridotte e la trasparenza delle larve zebrafish consentire l'imaging delle dinamiche dell'infezione a livello cellulare sia per ospite e patogeno. Larve transgenica con fluorescenti innate cellule immunitarie possono essere utilizzate per identificare specifici tipi di cellule coinvolte nella infezione ^22-24. Modificati oligonucleotidi antisenso (Morpholinos) possono essere utilizzati per abbattere i vari componenti del sistema immunitario come NADPH ossidasi dei fagociti e di studiare i cambiamenti in risposta a Fungal infezione ^5. Oltre ai vantaggi etici e pratici di utilizzo di un piccolo vertebrato inferiore, le larve zebrafish offre la possibilità unica di immagine la battaglia campale tra patogeno e ospite sia intravitally e nel colore.

Il pesce zebra è stato utilizzato per l'infezione modello per un numero di batteri patogeni umani, e ha contribuito a notevoli progressi nella nostra comprensione delle infezioni da micobatteri ^{3, 25.} Tuttavia, solo recentemente sono molto più grandi patogeni quali funghi stati utilizzati per infettare larva ^{5, 23, 26,} e ad oggi non c'è stata una descrizione dettagliata visiva della metodologia infezione. Qui vi presentiamo le nostre tecniche di microiniezione ventricolo rombencefalo di prim ²⁵ zebrafish, comprese le nostre modifiche ai protocolli precedenti. I nostri risultati con il modello larvale zebrafish per infezione fungina divergono da studi in vitro e rafforzare la necessità di esaminare l'ospite-patogeno Interaazione nel complesso contesto del paese ospitante, piuttosto che il sistema semplificato del piatto Petri ^5.

Protocollo

Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti sotto la cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) protocollo A2009-11-01.

1. Morfolino e Piatti iniezione larvali

Sperimentale durata: * (10-15 minuti)

Grado di difficoltà: *

1. Per le iniezioni a base di uova, preparare una soluzione al 2% di agarosio in acqua sterile e forno a microonde. Quando la soluzione si è raffreddata versare una parte in un extra piatto fondo Petri (Fisher Scientific) fino a quando non è mezzo pieno. Raffreddare su ghiaccio e assicurarsi che la piastra sia a livello.
2. Una volta che il piatto è raffreddato, versare uno strato 15 mL superiore del 2% agarosio. Spruzzare una iniezione uovo scanalato stampi in plastica (Adaptive Tools Scienza) con acqua sterile da una bottiglia a spruzzo. Disporre con attenzione il solco stampo giù nel caldo agarosio. Quando l'agarosio si è raffreddato, usare una spatola metallica piana (VWR Scientific) di dissociare lo stampo dal agarosa. Rimuovere lentamente la griglia dal agarosio. Avvolgere i piatti embrioni iniezione in Parafilm (VWR Scientific) e conservare invertito a 4 ° C.
3. Per iniezioni larvali di pesce, preparare una soluzione al 2% agarosio come descritto. Versare la soluzione in una capsula Petri di dimensioni standard (VWR Scientific) e mettere da parte fino a quando non si solidifica. Piatti di iniezione Wrap larvali in Parafilm e conservare invertita a 4 ° C.

2. Cultura Preparazione funghi

Sperimentale durata: ** (30 minuti)

Grado di difficoltà: **

1. Preparare estratto di lievito, peptone-destrosio (YPD) piastre di agar: 10 g / litro di estratto di lievito, 20 g / litro peptone, 20 g / litro destrosio, e 20 g / litro di agar e in autoclave. Per preparare liquido YPD 10 g / litro di estratto di lievito, 20 g / litro peptone, 20 g / litro e destrosio autoclave 20-30 minuti a 121 ° C.
2. Due giorni prima infezioni preparare un piatto di pesce striscia da congelatole scorte di Candida albicans culture su agar YPD per ottenere singole colonie.
3. Incubare a 37 ° C per una notte.
4. Mettere 5 ml di brodo YPD in 16 tubi di diametro da 150 x cultura (VWR Scientific).
5. Il giorno prima che le infezioni dei pesci prendere 1 piccola colonia in agar YPD con un tassello di legno (VWR Scientific). Mettere il bastone nel tubo cultura e turbinano attorno al risospendere colonia nel liquido YPD.
6. Grow notte a 37 ° C su un tamburo Culture TC-7 Roller tessuto dotato di un 14-pollici ruota provetta (New Brunswick Scientific).
7. Il giorno successivo, spin down 1 ml di cultura a 14000x g per 1 minuto in una provetta da 1,7 mL (Axygen). Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in liquido residuo con vortex (VWR Scientific).
8. Aggiungere 1 ml 1x tampone fosfato isotonico (VWR Scientific) e far girare come descritto in precedenza.
9. Ripetere il lavaggio PBS 3 volte.
10. Diluire diluizione 1:100 in 1x PBS (10 microlitri di C. albicans lavato in 990 microlitri 1x PBS).
11. Conta su un emocitometro (VWR Scientific).
12. Diluire a 10 ⁷ cellule / ml.

3. Infezioni zebrafish

Sperimentale durata: **** (1-3 ore)

Grado di difficoltà: ****

1. Raccogliere embrioni conformemente al punto 5 e conservare in uova-acqua, 60 mg / L sali Instant Ocean (Fisher Scientific) in acqua deionizzata sterile.
2. Utilizzando un microscopio da dissezione come il SZ61 Olympus (Olympus), embrioni dechorionate il giorno infezione. Utilizzare le pinzette Dumont Dumoxel (VWR Scientific) per tirare il corion ²⁷ parte come aprire un sacchetto di patatine, o delicatamente colpire le pinzette in posizione chiusa nel corion e poi lentamente aprirli. Il pesce dovrebbe comparire a destra, fuori del corion.
3. Agitare il piatto più profonda Petri con il coperchio per spostare pesci al centro del piatto. Trasferire il pesce al coperchio del piatto. Rimuovere l'acqua e uovasostituire con mezzi freschi. Aggiungere il pesce alla media.
4. Piatti caldi di iniezione larvali in un incubatore a 28 ° C. Preparare tricaine metano solfonato (Western Chemical Inc.) diluizione a 200 ug / mL per anestetizzare i pesci.
5. Contare il numero desiderato di larve per infezione (20-50 pesce). Mettere il pesce in soluzione metano solfonato tricaine e attendere 1-2 minuti fino a quando non smettono di muoversi.
6. Accendere l'unità MPPI-3 ad iniezione (Applied Scientific Instruments). Accertarsi che il pressostato è su "pulse" e la "durata dell'impulso" è impostato su 9 con 3 PSI per l'unità contropressione. Aprire la valvola al serbatoio di azoto fino a quando la pressione sul gruppo di iniezione legge 30 PSI.
7. Caricare un tirato micropipetta ²⁸ con 5 pl di vortexata Candida albicans ad una concentrazione di 1x10 ⁷ cellule / ml. Posizionare la micropipetta nel supporto micropipetta (Applied Scientific Instruments). Riempire un vuoto capsula Petri più profonda con l'acqua. Spostare la micropipetta finché la punta is all'interno di vista sfiora la superficie dell'acqua tramite microscopio a dissezione e l'uso delle pinzette Dumont Dumoxel (VWR Scientific) per tagliare l'ago di circa 3 mm dalla punta della pipetta tirato.
8. Premete l'interruttore a pedale (Applied Scientific Instruments) per verificare che l'ago è stato ritagliato. Si dovrebbe vedere il liquido si disperdono se hanno avuto successo. Il diametro del bolo liquido dovrebbe essere non più grande del diametro della pupilla di prim ²⁵ larva zebrafish (0,21 mm, ottenendo una sfera di 4,9 nL in volume). Regolare la pressione di conseguenza se il bolo liquido è troppo grande o troppo piccolo.
9. Anestetizzare la pesce in metano solfonato tricaine (200 pg / mL). Una volta che il pesce ha smesso di muoversi, agitare il piatto con il coperchio fino a quando i pesci sono nel centro. Raccogliere 50 pesci usando una pipetta di trasferimento (Fisher Scientific). Toccare il lato della pipetta per risolvere il pesce verso la punta. Pipettare delicatamente pesce sul piatto larvale agarosio utilizzando come liquido meno possibile.
10. Linea il pesce con una bacchetta di vetro liscio (attenzione a non schiacciarli!). Aspirare quanto più liquido possibile, fuori del piatto. Utilizzare un Kimwipe ad evacuare l'umidità.
11. Posizionare il piatto delle larve di agarosio con il pesce sotto il microscopio fino ad ottenere una buona vista del pesce e l'ago allo stesso tempo. Spostare l'ago di vetro verso il pesce. Zoom sia il pesce e l'ago, come si posiziona l'ago verso il pesce. Con attenzione spostare l'ago di vetro nella vescicola otica ^{27, 29} (orecchio) del primo pesce. Saprete una volta che hai spostato l'ago nel pesce perché quando si preme l'interruttore a pedale (Applied Scientific Instruments), il ventricolo rombencefalo si solleva leggermente.
12. Premete l'interruttore a pedale (Applied Scientific Instruments) e guardare il liquido si disperdono all'interno rombencefalo del pesce ventricolo ^27. Ritrarre l'ago dal pesce e passare al pesce successivo. Ripetere la procedura fino a quando è stata iniettata tutti i pesci nel piatto. Rimuovere qualsiasi dead pesce e iniettare sostituzioni per mantenere il numero corretto (50 pesci). Per ogni gruppo di 50 pesci iniettato un ago microiniezione nuova deve essere preparato, o C. albicans si deposita nella parte inferiore dell'ago e zoccoli, o getta via la concentrazione iniettato.
13. Lavare il pesce fuori del piatto inclinando il piatto e spruzzare uovo acqua sul pesce in un piatto fondo più pulito Petri contenente 60 mL di uova acqua. E 'importante non lasciare il pesce sul agarosio per più di 15-20 minuti o si seccano e muoiono.
14. Ripetere l'intero processo di iniezione fino al termine. Non dimenticare PBS e non patogeni iniettati controlli.
15. Al termine, tenere il pesce a 28 ° C.
16. Chiudere il rubinetto della bombola di azoto. Spostare l'interruttore unità di iniezione da "impulso" al "continuo" per alleviare la pressione nella linea del serbatoio, la pressione dovrebbe scendere a zero a questo punto. Passare unità di iniezione torna a "impulsi". Spegnere l'unità di iniezione e ripulire l'area di lavoro.

4. Preparazione del Pesce per l'imaging

Sperimentale durata: ** (30 minuti)

Grado di difficoltà: **

1. Preparare la soluzione metano solfonato tricaine come prima (200 pg / mL). Esca pesce infetto, e trasferirli in tricaine.
2. Preparare 47,9 mL 0,4% agarosio low-melt (VWR scientifica) in uova acqua. Riscaldare la soluzione da microonde. Raffreddare a 37 ° C e aggiungere metano solfonato tricaine (200 pg / mL) alla miscela
3. Una volta che i pesci sono immobilizzati in metano solfonato tricaine, pesce pipetta individuo in una piastra di Petri (VWR scientifica) contenente 0,4% agarosio a basso punto di fusione (VWR Scientific).
4. Quindi, spostare i pesci dal basso punto di fusione di agarosio in singoli pozzetti di un piatto fondo di vetro (MatTek Corporation) per l'imaging. Uso come poco bassa temperatura di fusione agarosio possibile così il pesce giace piatto sul fondo del piatto. Utilizzare solo abbastanza del tricaine-agarosio per riempire il incerchi ner del piatto fondo di vetro.

5. Modifiche relative a Giove protocolli

Micropipette per Microiniezione

Sperimentale durata: * (10-15 minuti)

Grado di difficoltà: *

1. Tirare canne cave di vetro BF120-69-10 (Strumenti Sutter) con un Flaming Brown Micropipetta Estrattore modello P-97 (Sutter Instruments) a seconda Yuan et al. ^30. Scegliere il programma # 7 con il calore seguenti condizioni = 470, Velocità = 120, Time = 200. L'ago risultante è di 8 mm da punta a smusso e, una volta tagliati a 3 mm sopra la punta ha un diametro di circa 10 pm.
2. Caricare una micropipetta di vetro nelle staffe. Selezionare "Pull". Il filamento di riscaldamento riscalda l'ago secondo i parametri del programma e la lastra di vetro si separerà in due micropipette tirato. Micropipette Conservare in un contenitore pipetta (Suttstrumenti er).

Di raccolta degli embrioni, iniezione Morpholino e manutenzione

Durata sperimentale: *** (1-2 ore)

Grado di difficoltà: ***

3. Raccogliere embrioni secondo i metodi di Rosen et al. ^31. Utilizzare un setaccio di plastica (Wares di Knutsford) per raccogliere le uova dal serbatoio deposizione delle uova (ambienti acquatici). Tenere il setaccio a testa in giù sopra un piatto di Petri più profondo e risciacquare con acqua vasca di raccolta delle uova.
4. Per la preparazione morfolino, aggiungere 300 microlitri di acqua sterile a 300 nanomoli di morfolino (GeneTools, LLC). Questo dà uno stock di lavoro di 1,0 mm.
5. Controllare la concentrazione del morfolino utilizzando un NanoDrop (Thermo Scientific). Selezionare "acido nucleico e cambiare il tipo di campione di" altro "e lunghezza d'onda a 265. Inserire la costante moltiplicando il peso molecolare del morfolino da 1000 diviso il absorptivity coefficiente di figurare nella scheda di morfolino proprietà oligo.
6. Bianche il NanoDrop con 2 pl 0,1 N HCl. Diluire 5 pl della soluzione morfolino in 95 pl di HCl 0,1 N (20x diluizione). Mettere 2 microlitri della diluizione sul piedistallo NanoDrop e misura click. Moltiplicare la concentrazione per il fattore di diluizione (20). Questo dà una concentrazione operativa di morfolino. Per calcolare la concentrazione millimolare dividere la concentrazione ottenuta dal peso molecolare del morfolino.
7. Preparare una stock di lavoro di morfolino Danieau in tampone (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO _4, 0,6 mM Ca (NO _{3) 2,} 5.0 mM di HEPES, pH 7,6) e 0,01% di rosso fenolo (VWR Scientific).
8. Per lavoro iniezione morfolino seguire il protocollo secondo Rosen et al. ³¹ e Yuan et al. ^30. Lavare i piatti di iniezione morpholino con uovo e acqua calda a 28 ° C per 15 minuti. Rimuovere l'acqua dai piatti di iniezione e line-up one-cstadio embrioni ell nelle scanalature del piatto di iniezione (preparato dalla sezione 1) con una pipetta di trasferimento. Ogni piastra grado di contenere circa 250 uova. Iniettare 1-2 embrioni allo stadio di cellule con morfolino. Uova rimarrà in uno stadio di cellule per 15 minuti ^27.
9. Lavare le uova iniettate con uovo-acqua quando finiti (acqua deionizzata sterile con 60 mg / L sali Instant Ocean) e porlo in 60 mL di uova in acqua supplementare piastre di Petri profonde. Piatti di iniezione Morpholino può essere riutilizzato. Risciacquare con acqua uovo quando hai finito e memorizzare invertita a 4 ° C.
10. Per la conservazione di embrioni aggiungere 60 ml di acqua uova al piatto. Contare i 110 embrioni con una pipetta di trasferimento in diverse capsule di Petri profonde supplementari con 60 mL uovo d'acqua. Aggiungi 0,00003% blu di metilene per prevenire la crescita microbica e embrioni incubare a 28 ° C.
11. Per accelerare lo sviluppo di embrioni embrioni mantenere i piatti a 33 ° C per 24 ore e stage secondo Kimmel et al. ^27, consentendo di sviluppare embrioni ad una testaAngolo del tronco di 75 ° (Prim 25 stage ^27).
12. Per il lavoro l'infezione larvale tenere embrioni a 28 ° C dopo l'iniezione con il C. albicans.
13. Ogni giorno sostituire i piatti embrione con 60 ml di acqua fresca all'uovo.

Imaging

Sperimentale durata: ***** (1-5 ore)

Grado di difficoltà: ***

14. Preparare il pesce in basso punto di fusione di agarosio (secondo il punto 4.2) con tricaine in piatti a base di imaging fondo di vetro (MatTek Corporation) come descritto in precedenza. Porre la capsula in un IX-81 Olympus (Olympus) stage microscopio invertito. Portare il pesce a fuoco con un ingrandimento di 4x in contrasto interferenziale differenziale (DIC) della luce. Le immagini possono essere catturate a 4x, 20x e 40x di ingrandimento in DIC, TRITC (isotiocianato rodamina tetrametil) e FITC (isotiocianato di fluorescina), impostazioni del filtro.
15. Utilizzare un Olympus IX-81 microscopio invertito con un FV-1000 sistema di scansione laser confocale secondo Ariga et al. ^32. Condurre corsi a tempo con ingrandimento 40x impostando Z-stack con fette di 1-1,5 micron ogni ora di infezione.
16. Per l'imaging lungo andamento nel tempo di 2 ore o più, disporre uno strato di agarosio a bassa fusione sulla parte superiore del pesce nel piatto di imaging ogni 2-3 ore. Questo impedisce l'agarosio si secchi e la frantumazione il pesce mentre viene ripreso. Per i corsi di tempo lunghi con un piccolo numero di pesci, utilizzare una fase riscaldato (Bioptechs Inc.) per mantenere 28 ° C durante infezioni.

6. Risultati rappresentativi

Un esempio di un successo rombencefalo ventricolo C. infezione albicans in una larva zebrafish a 5 ore dopo l'infezione (IPU) e 24 HPI è illustrato nella (Figura 1). Macrofagi come cellule con inghiottito C. albicans si vedono nel ventricolo rombencefalo a 5 HPI. Entro il 24 HPI, C. albicans si trova all'interno dei macrofagi-like cells nel tessuto coda dorsale indicativa della candidosi disseminata. Questo risultato infezione è altamente dipendente da una precisa iniezione di 10-15 lievito forma C. albicans nel ventricolo rombencefalo. Proiezione di pesci infetti immediatamente post-iniezione può garantire questo.

Figura 1 transgenico fli1:. EGFP ^{22, 33} larva infettati con CaF2-yCherry Candida albicans e ripreso intravitally mediante microscopia confocale. (AC) 5 ore post-infezione (A) larva Infected con EGFP che esprimono macrofago-come le cellule nel sito di infezione (rombencefalo ventricolo) bar Scala = 100 micron. (B e C) le immagini ingrandimento maggiore di pesce stesso, mostrando C. albicans all'interno fagociti. Barra della scala = 100 micron per B e 10 micron per C. (DF) 24 ore post-infezione (D) larva infetta con candidosi disseminata, con CaF2-yCherry C. albicans all'interno EGFP macrophage cellule simili nel tessuto coda dorsale. Scala bar = 100 micron. (E e F) immagini forti ingrandimenti di pesce stesso, mostrando C. albicans nei tessuti della coda. Scala bar = 100 micron.

Discussione

Il metodo di microiniezione zebrafish qui presentata si differenzia da Gutzman et al. In ³⁴ che qui si dimostra l'iniezione attraverso la vescicola otica nel ventricolo rombencefalo di 36-48 larve HPF. Il metodo che permette di descrivere l'iniezione costante del 10-15 lievito nel ventricolo rombencefalo con danno tissutale ridotta. Questo protocollo produce inizialmente una infezione locale che si propaga attraverso il corpo da 24 HPI (figura 1) e determina letalità signifi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Vasche di deposizione	Habitat acquatici	2L
1,7 ml provette	Axygen	MCT-175-C
Istantanea Ocean	Fisher Scientific	S17957C
Extra piastre di Petri profonde	Fisher Scientific	08-757-11Z
Standard Scatole Petri	VWR Scientific	25384-302
Pipette di trasferimento	Fisher Scientific	13-711-7M
Estratto di lievito	VWR Scientificafic	90000-726
Peptone	VWR Scientific	90000-264
Destrosio	Fisher Scientific	D16-1
Agar	VWR Scientific	90000-760
Emocitometro monouso	VWR Scientific	82030-468
Soluzione tampone fosfato	VWR Scientific	12001-986
Dumont Dumoxel Pinzetta	VWR Scientific	100501-806
Tasselli di legno	VWR Scientific	10805-018
Kimwipes	VWR Scientific	300053-964
Low MeltAgarosio	VWR Scientific	12001-722
Agarosio per i piatti di iniezione	VWR Scientific	12002-102
Flaming Brown Micropipetta Puller	Sutter Instruments	P-97
Bacchette di vetro Hollow	Sutter Instruments	BF120-69-10	Per le canne di vetro vetro liscio dal riscaldamento sopra becco Bunsen
Pipettare Scatola	Sutter Instruments	BX10
MPPI-3 Sistema di iniezione	Applicata strumentazione scientifica	MPPI-3
Unità di pressione Indietro	Applicata strumentazione scientifica	BPU
Micropipetta Holder Kit	AppliStrumentazione scientifica ed	MPIP
Foot Switch	Applicata strumentazione scientifica	FSW
Micromanipolatore	Applicata strumentazione scientifica	MM33
Base magnetica	Applicata strumentazione scientifica	Base magnetica
Tricaine metano solfonato	Occidentale Chemical Inc.	MS-222
Dissezione Scope	Olimpo	SZ61 top SZX-ILLB2-100 di base
Microscopio confocale	Olimpo	IX-81 con la FV-1000 sistema di scansione laser confocale
TC-7 Roller Tissue Culture tamburo della ruota con il 14 pollici provetta	New Brunswick Scientific	TC-7
Imaging Piatti	MatTek Corporation	P24G-1.0-10-F
Puntali per il caricamento di aghi	Eppendorf	930001007
Griglie piastra colata	Adaptive Scienza Tools	TU-1
Fase riscaldata	Bioptechs Inc.	Delta T-5
Spatola piatta	VWR Scientific	82027-486
Setacci di plastica	Wares di Knutsford online	12 cm
Parafilm	VWR Scientific	52858-000
Vortex Genie	VWR Scientific	14216-184
16 x 150 mm Cultura tubi	VWR Scientific	60825-435
NanoDrop	Thermo Scientific	ND 2000
Rosso fenolo	VWR Scientific	97062-478
HCl	VWR Scientific	87003-216
NaCl	VWR Scientific	BDH4534-500GP
KCl	VWR Scientific	BDH4532-500GP
MgSO 4	VWR Scientific	BDH0246-500GP
Ca (NO 3) 2	VWR Scientific	BDH0226-500GP
HEPES	VWR Scientific	BDH4520-500GP
Morpholinos	GeneTools, LLC