手动排水的斑马鱼胚胎脑室

摘要

我们提出一个方法，收集脑脊液（CSF），并建立系统，缺乏的胚胎斑马鱼大脑脑室系统内脑脊液。 CSF的组成及其胚胎大脑发育过程中的要求，这使得进一步的检查。

摘要

脑脊液（CSF）是一种富含蛋白质的脑室内所含的流体。这是目前早期脊椎动物的胚胎发育过程中，坚持在整个生命。成人CSF认为，以减轻大脑，排除废物，并进行分泌的分子^1,2。在成人和年龄较大的胚胎中，大多数的CSF是由脉络丛，一系列的高度血管化的分泌位于脑室^3-5相邻的区域。在斑马鱼，脉络丛完全形成受精后144小时^{（HPF）6。}在此之前，在包括鼠标，一个显着量的胚胎CSF（eCSF）的斑马鱼和其他脊椎动物胚胎是本。这些数据和研究表明，在鸡的神经上皮分泌在开发的早期，可能是之前的主要来源eCSF发展脉络丛^7。

eCSF包含了大约3倍以上的蛋白质吨韩成人CSF，这表明它可能具有重要作用，在发展^8,9。研究表明，在小鸡和老鼠分泌因子eCSF，流体压力，或这些的组合，是非常重要的神经发生，基因表达，细胞增殖和细胞生存的神经上皮^10-20中。人，大鼠，小鼠和小鸡eCSF的蛋白质组学分析，已经确定了许多蛋白质​​可能是必要的CSF功能。这些包括胞外基质成分，载脂蛋白，渗透压调节蛋白和蛋白参与细胞死亡和增殖^21-24。然而，复杂的功能在很大程度上是未知的eCSF。

我们已经开发出一种方法，用于除去从斑马鱼脑室eCSF，从而允许识别eCSF组件，并在开发过程中进行分析的eCSF规定的。虽然可以采集更多eCSF，从其他脊椎动物系统W第i个较大的胚胎，eCSF可以收集到的斑马鱼发育的早期阶段，与遗传或环境条件下，导致脑室体积异常或形态。拆卸和回收的eCSF允许质谱分析，调查eCSF功能，并重新选择因素破入脑室分析它们的功能。因此，斑马鱼早期胚胎的可访问性可以在开发过程中的eCSF功能进行详细的分析。

研究方案

1。准备显微注射针和细胞电

1. 根据制造商的指示，填写Eppendorf公司CellTram油微量注射器装置与矿物油。
2. 准备显微注射针拉毛细管萨特仪器针拔出器。
3. 微操作机器人连接到Eppendorf公司CellTram上安装针。
4. 小心打破针尖。为针尖大小均匀，用千分尺测量，或比较的参考针。
5. 填写针的长度与油，使用CellTram，推动油价下跌的长度，小心，以避免任何气泡。

2。准备胚胎

1. 在1％的琼脂糖涂布菜用1-200微升的移液管尖戳孔，并除去琼脂糖插头。填写菜与胚胎媒体（根据韦斯特^25）。
2. 钳，dechorionate的胚胎体视显微镜下。
3. 转让dechorionated胚胎到琼脂糖凝胶涂层菜。
4. 若要麻醉胚胎，三卡因（0.1毫克/毫升）添加琼脂糖培养皿直到胚胎停止移动（韦斯特²⁵根据）。

3。排水eCSF

1. 东方胚胎的琼脂糖和最接近显微操纵后部两侧的孔中与它们的尾巴，允许可视化的大脑的背侧。
2. 针定位在菱0/1的铰接点或后脑心室（ 图1A）的最宽点。
3. 小心刺破屋顶板的后脑心室进入蛋黄，千万不要去通过深入的大脑。
4. 沥干eCSF使用CellTram和收集液中显微注射针。要小心，以避免任何细胞。

4。成分分析收集eCSF的

1. 一旦被收集在针eCSF，仔细停止从CellTram的吸入。
2. 莫从下针，没办法菜，小心地将针管所需的缓冲区。
3. 使用CellTram，沥干eCSF满分针进入尝试，以避免污染的油溶液与缓冲。
4. 为了除去细胞您已吸气一起以10,000×g的eCSF，自旋eCSF。收集未受污染的eCSF（上清），并存储在-80°C，直到准备进行进一步的分析。

5。重新的选择因素

1. 沥干eCSF在所需的时间间隔期间每2小时，由于流体在此期限内补充。排水时间点之间，取出针和储存的胚胎在28.5°C，或所需的温度。
2. 将第二的微量移液器针与测试因素。
3. 地点连接到微量注射器针头插入微操作机器人。
4. 调整注射量的墨滴大小通过测量在油和调整喷射时间和p 1 NLressure。
5. 注入1-2 NL到如前所述²⁶脑室。

结果

一个排水脑室的一个例子示出在图1B-C。作为他们缺乏eCSF的（ 图1B和C），脑室倒塌。可以看出在背侧的图像（ 图1B-C，以及图2A-D）的后脑神经上皮确实保留其特征的形态，而且似乎是开放，尽管缺乏eCSF可能是由于强大的铰接点。然而，横向次（ 图2A'-D'）表明已后脑脑室沥干，的存在下，一薄的柔性顶板上皮折叠腹侧一致。在?...

讨论

使用这种技术的手动排水eCSF的从斑马鱼脑室用于确定eCSF在开发过程中的要求将是有益的。此外，这种技术将允许在胚胎发育过程中描述的eCSF蛋白更新。在此期间，不同的蛋白质的鉴定将能够进一步调查到CSF和大脑发育过程中的潜在作用的功能。在脊椎动物中，在eCSF（FGF2，IGF2，视黄酸和载脂蛋白）的一些因素有证明作用在神经上皮细胞存活，增殖和神经细胞^{13,17,20,23,27,28。}然而，似乎有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
Eppendorf公司CellTram油	Eppendorf公司	516 000.025
矿物油	西格玛	M8410
三卡因粉	西格玛	A5040
毛细管	FHC公司	30-30-1