JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur Liquor (CSF) zu sammeln und ein System, das CSF fehlt im embryonalen Zebrafischgehirn ventrikuläre System zu erstellen. Dies ermöglicht eine weitere Untersuchung der CSF Zusammensetzung und seine Forderung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns.

Zusammenfassung

Liquor (CSF) ist ein Protein reiche Flüssigkeit innerhalb der Ventrikel im Gehirn enthalten. Es ist während der frühen Wirbeltiere Embryonalentwicklung vorhanden und bleibt während des gesamten Lebens. Adult CSF wird angenommen, dass das Gehirn dämpfen, entfernen Abfallprodukte und tragen sezernierte Moleküle 1,2. Beim Erwachsenen und älteren Embryo, wird die Mehrheit der CSF durch den Plexus choroideus, eine Reihe von stark vaskularisierten sekretorischen Bereiche benachbart angeordnet, um den Hirnkammern 3-5 hergestellt. Im Zebrafisch wird der Plexus komplett bei 144 Stunden nach der Befruchtung (hpf) 6 gebildet. Zuvor sowohl Zebrafisch und andere Wirbeltierembryonen einschließlich Maus, eine signifikante Menge an embryonalen CSF (ECSF) vorhanden ist. Diese Daten und Studien chick vermuten, dass die Neuroepithel sekretorischen früh in der Entwicklung ist, und kann die Hauptquelle der ECSF vor Plexus Entwicklung 7 sein.

ECSF enthält etwa dreimal mehr Protein than Erwachsenen CSF, was darauf hindeutet, dass es eine wichtige Rolle bei der Entwicklung 8,9 haben. Studien bei Huhn und Maus demonstrieren, dass sekretierten Faktoren im ECSF, Fluiddruck oder eine Kombination von diesen, die wichtig sind für die Neurogenese, Genexpression, Zellproliferation und Zellüberleben im Neuroepithel 10-20. Proteomik Analysen von Mensch, Ratte, Maus und chick ECSF haben viele Proteine, die notwendig sein CSF-Funktion identifiziert. Dazu gehören Komponenten der extrazellulären Matrix, Apolipoproteine, den osmotischen Druck regulierende Proteine ​​und Proteine ​​in Zelltod und Proliferation 21-24 beteiligt. Jedoch sind die komplexen Funktionen des ECSF weitgehend unbekannt.

Wir haben ein Verfahren zum Entfernen von Zebrafisch ECSF Hirnkammern entwickelt, so dass für die Identifizierung des ECSF Komponenten und zur Analyse der ECSF Anforderung während der Entwicklung. Obwohl mehr ECSF aus anderen Wirbeltieren Systeme w gesammelt werdenith größeren Embryonen können ECSF von den frühesten Stadien der Zebrabärblingentwicklung gesammelt werden, und unter genetischen oder Umgebungsbedingungen, die zu abnormen Hirnventrikel Volumen oder Morphologie führen. Entfernen und Sammeln von ECSF ermöglicht für die massenspektrometrische Analyse, Ermittlung von ECSF Funktion, und die Wiedereinführung der ausgewählten Faktoren in die Ventrikel zu Assay ihre Funktion. So ist die Erreichbarkeit des frühen Zebrafischembryo ermöglicht eine detaillierte Analyse der ECSF Funktion während der Entwicklung.

Protokoll

Ein. Vorbereiten Mikroinjektion Needles and Cell Tram

  1. Füllen Eppendorf CellTram Öl Mikroinjektor Apparat mit Mineralöl nach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Bereiten Mikroinjektion Nadeln durch Ziehen Kapillarrohre mit Sutter Instrumente Nadel abziehen.
  3. Montieren Nadel auf Mikromanipulator an Eppendorf CellTram.
  4. Vorsichtig brechen die Spitze der Nadel. Für eine gleichmäßige Größe der Spitze, mit einem Mikrometer messen oder vergleichen, um eine Referenz Nadel.
  5. Füllen Sie die Länge der Nadel mit Öl, mit dem CellTram Öl über die gesamte Länge zu schieben, dabei darauf achten, keine Blasen zu vermeiden.

2. Vorbereitung der Embryonen

  1. Stoßen Löcher in einem 1% Agarose-beschichteten Schale mit einem 1-200 ul Pipettenspitze und entfernen Agarose Steckern. Füllen Schale mit Embryo Medien (hergestellt nach Westerfield 25).
  2. Mit Pinzette dechorionate Embryonen unter Stereomikroskop.
  3. Übertragen dechorionated Embryonenin Agarose-beschichteten Gericht.
  4. Embryonen zu betäuben, fügen Tricaine (0,1 mg / ml) an Agarose Antenne, bis Embryonen bewegten Anschlag (hergestellt nach Westerfield 25).

3. Entleeren des ECSF

  1. Orient die Embryonen mit ihren Endstücken in den Löchern der Agarose und ihre hinteren Seiten am nächsten zu dem Mikromanipulator, so dass für die Visualisierung der dorsalen Seite des Gehirns.
  2. Positionieren Sie die Nadel am Rhombomer 0/1 Scharnier-Punkt oder der breitesten Stelle Hinterhirn Ventrikel (Abbildung 1A).
  3. Sorgfältig durchbohren Dachblech Rautenhirn Ventrikel sicher zu sein, um nicht durch die Tiefe des Gehirns in dem Eigelb zu gehen.
  4. Lassen Sie das ECSF mit dem CellTram sammeln und Flüssigkeit in Mikroinjektionsnadel. Seien Sie vorsichtig, um alle Zellen zu vermeiden.

4. Das Sammeln der ECSF für Composition Analysis

  1. Sobald die ECSF in der Nadel gesammelt wird, zu stoppen sorgfältig Absaugung aus dem CellTram.
  2. Move die Schale aus unter der Nadel und die Nadel genau positionieren zu einem Schlauch mit dem gewünschten Puffer.
  3. Mit dem CellTram, lassen Sie das ECSF aus der Nadel in den Puffer zu vermeiden versucht Verunreinigung der Lösung mit Öl.
  4. Um Zellen, die Sie haben zusammen mit dem ECSF, Spin ECSF bei 10.000 x g abgesaugt entfernen. Unberührten ECSF (Überstand) und bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse zu sammeln.

5. Wiedereinführung der ausgewählten Faktoren

  1. Lassen Sie das ECSF alle 2 Stunden während der gewünschte Zeitintervall, da die Flüssigkeit in diesem Zeitraum wieder aufgefüllt wird. Zwischen Entwässerungszeit-Punkte, entfernen Sie die Nadel und bewahren die Embryonen bei 28,5 ° C oder Temperatur gewünscht wird.
  2. Legen zweiten Mikropipette Nadel mit Test-Faktor.
  3. Ort Nadel in den Mikromanipulator Mikroinjektorkopfs befestigt.
  4. Passen Injektionsvolumen bis 1 nl durch Messung der Tropfengröße in Öl und Einstellen Einspritzzeit und pressure.
  5. Inject 1-2 nl in Hirnkammern wie zuvor beschrieben 26.

Ergebnisse

Ein Beispiel eines durchlässigen Hirnventrikel ist in 1B-C gezeigt. Hirnkammern sind zusammengebrochen, als sie ECSF (Abbildung 1B vs C) fehlt. Wie in dorsalen Bilder (1B-C und 2A-D) die Hinterhirn Neuroepithel macht behalten ihre charakteristische Morphologie und scheint trotz fehlender ECSF wahrscheinlich durch robuste Scharnier-Punkte offen gesehen. Allerdings zeigen Seitenansichten (Abbildung 2A'-D '), dass die Hinterhirn V...

Diskussion

Die Verwendung dieser Technik, um manuell ablaufen ECSF vom Zebrafisch Hirnkammern nützlich sein wird für die Bestimmung der Voraussetzung für ECSF während der Entwicklung. Darüber hinaus wird diese Technik Beschreibung des ECSF Proteinprofil Laufe der Embryonalentwicklung ermöglichen. Identifizierung verschiedener Proteine ​​während dieser Zeit ermöglicht genauere Ermittlung der Funktion des CSF und seine potenzielle Rolle während der Entwicklung des Gehirns. In Amnioten haben einige Faktoren ECSF (IGF2, F...

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Institute for Mental Health und der National Science Foundation unterstützt. Besonderer Dank geht an Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson und anderen Sive lab Mitglieder für viele hilfreiche Diskussionen und konstruktive Kritik, und Olivier Paugois für Experten Fische Tierhaltung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Name des Reagenz Firma Katalog-Nummer
Eppendorf CellTram Oil Eppendorf 516 000.025
Mineralöl Sigma M8410
Tricaine Pulver Sigma A5040
Kapillarrohre FHC Inc. 30-30-1

Referenzen

  1. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  2. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
  3. Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
  4. Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
  5. Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
  6. Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
  7. Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
  8. Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
  9. Zheng, W., Chodobski, A. . The blood-cerebrospinal fluid barrier. , (2005).
  10. Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
  11. Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
  12. Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
  13. Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
  14. Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
  15. Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
  16. Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
  17. Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
  18. Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
  19. Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, S57-S59 (2001).
  20. Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
  21. Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
  22. Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
  23. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
  24. Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
  25. Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
  26. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  27. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
  28. Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
  29. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  30. Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
  31. Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

NeuroscienceAusgabe 70EntwicklungsbiologieMedizinAnatomiePhysiologieZebrafischDanio rerioECSFNeuroepithelGehirn ventrikul re SystemGehirnMikrochirurgieTiermodell

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten