JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) toplamak ve embriyonik zebrafish beynin ventriküler sistemde BOS yoksun bir sistem oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu embriyonik beyin gelişimi sırasında BOS kompozisyonu ve onun ihtiyacının daha fazla inceleme için izin verir.

Özet

Beyin omurilik sıvısı (BOS) beyin ventriküller içinde bulunan bir protein açısından zengin bir sıvıdır. Erken omurgalı embriyonik gelişim sırasında mevcuttur ve yaşam boyu devam eder. Yetişkin BOS, beyin yastık atık kaldırmak ve salgılanan moleküller 1,2 taşımak için düşünülmektedir. Yetişkin ve yaşlı embriyoda BOS çoğunluğu koroid pleksus, beyin ventriküller 3-5 bitişiğindedir çok kanlanan sekretuar bölgelerinde bir dizi yapılır. Zebra balığı olarak, koroid pleksus tam 144 saat sonrası fertilizasyon (HPF) 6 oluşur. Bundan önce, fare embriyonik BOS (eCSF) önemli bir kısmını içeren zebrafish ve diğer ikisi de omurgalı embriyolarının mevcuttur. Piliç Bu veriler ve çalışmalar nöroepitelyumda gelişiminde erken sekretuar ve öncesi koroid pleksus gelişimi 7 eCSF en önemli kaynağı olabileceğini düşündürmektedir.

eCSF yaklaşık üç kat daha fazla protein içerir tkalkınma 8,9 sırasında önemli bir rol oynayabileceğini han yetişkin BOS, düşündüren. Civciv ve fare yapılan çalışmalar eCSF, sıvı basınç, ya da bunların bir kombinasyonu olarak salgılanan faktörler epitele 10-20 nöron, gen ekspresyonu, hücre çoğalması ve hücre hayatta kalma için önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Insan, sıçan, fare ve civciv eCSF proteinle ilgili analizler BOS fonksiyonu için gerekli olabilecek birçok protein belirledik. Bu hücre ölümü ve çoğalma 21-24 dahil hücre dışı matris bileşenleri, apolipoproteinler, ozmotik basıncı düzenleyen proteinleri, ve proteinleri içerir. Ancak, eCSF karmaşık işlevleri büyük ölçüde bilinmemektedir.

Dolayısıyla eCSF bileşenlerin tanımlanması ve geliştirilmesi sırasında eCSF ihtiyaç analizi için izin zebrafish beyin ventriküllerden eCSF uzaklaştırılması için bir yöntem geliştirmiştir. Daha eCSF diğer omurgalı sistemleri w tahsil edilebilmesine rağmenITH büyük embriyolar, eCSF zebrafish gelişiminin erken aşamalarında toplanan ve anormal beyin ventrikül hacim veya morfolojisi neden genetik veya çevresel koşullar altında yapılabilir. ECSF çıkarılması ve toplama tahlil etmek ventriküllerin içine belirli faktörler kütle spektrometrik analizi, eCSF fonksiyonu araştırmalar, yeniden yerleştirilmesi ve bunların fonksiyonları için olanak sağlar. Böylece erken zebrafish embriyo erişilebilirlik gelişimi sırasında eCSF fonksiyonunun ayrıntılı analizi için izin verir.

Protokol

1. Mikroenjeksiyon İğneleri ve Hücre Tramvay hazırlanması

  1. Üreticinin talimatlarına göre mineral yağ ile Eppendorf CellTram petrol mikroenjektör aparatı doldurun.
  2. Sutter araçlar iğne çektirmenin kullanarak kılcal tüpler çekerek mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın.
  3. Eppendorf CellTram bağlı mikromanipülatör üzerine iğne takın.
  4. Dikkatlice iğne ucu bölünürler. Üniform uç boyutu için, bir mikrometre ile ölçümü veya referans iğne karşılaştırın.
  5. Kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, uzunluğu aşağı petrol itmek CellTram kullanarak, yağ ile iğnenin uzunluğu doldurun.

2. Embriyolar hazırlanması

  1. Bir 1-200 ul pipet ile% 1 agaroz kaplı çanak delikleri Poke ve agaroz tıpaları çıkarın. Embriyo medya (Westerfield 25'e göre yapılan) ile çanak doldurun.
  2. Stereomikroskop altında forseps, dechorionate embriyolar kullanma.
  3. Dechorionated embriyolar transferAgaroz kaplı çanak içine.
  4. Embriyolar (Westerfield 25'e göre yapılan) hareket durdurana kadar embriyo uyutmak için, agaroz çanak Tricaine (0.1 mg / ml) ekleyin.

3. ECSF boşaltılması

  1. Agaroz ve mikromanipülatör yakın kendi arka tarafın delikleri kendi kuyrukları ile Orient embriyolar, beynin dorsal yüzü görselleştirme için izin.
  2. Rhombomere 0/1 menteşe noktası veya arka beyin ventrikülü (Şekil 1A) en geniş noktada iğne yerleştirin.
  3. Sarısı içine beynin derinliği boyunca gitmek emin olmak arka beyin ventrikül dikkatlice pierce tavan plakası.
  4. CellTram kullanarak eCSF boşaltın ve mikroenjeksiyon iğne sıvı toplamak. Herhangi bir hücre önlemek için dikkatli olun.

4. Kompozisyon Analiz eCSF Toplama

  1. ECSF iğne içinde toplandıktan sonra, CellTram emme dikkatli bir şekilde durmaktadır.
  2. Moiğnenin altından çanak ettik ve dikkatlice istenilen tampon içeren bir tüp içine iğne yerleştirin.
  3. CellTram kullanarak, yağ ile çözüm kontamine olmasını önlemek için çalışıyoruz tampon içine iğne eCSF boşaltın.
  4. 10,000 x g'de eCSF, spin eCSF birlikte aspire olduğunu hücreleri çıkarmak için. Toplamak daha fazla analiz için -80 eCSF (süpernatant) ve mağaza ° C kadar hazır kirlenmemiş.

5. Seçilen Faktörler reintroduction

  1. Sıvı o süre içinde doldurulan olduğundan, istenen zaman aralığı boyunca eCSF her 2 saat boşaltın. Sıcaklık drenaj zaman noktalarında Arasında, iğne kaldırmak ve 28.5 ° C'de embriyolar saklamak veya arzu.
  2. Test faktörü ikinci mikropipet iğne yerleştirin.
  3. Mikromanipülatör içine yerleştirin iğne mikroenjektör bağlı.
  4. Petrol ve ayarlama enjeksiyon zamanı ve p damla boyutu ölçerek 1 nl enjeksiyon seviyesini ayarlamaressure.
  5. Daha önce 26 açıklandığı beyin ventriküller içine 1-2 nl enjekte.

Sonuçlar

Bir süzülmüş beyin ventrikül bir örneği Şekil 1B-C 'de gösterilmiştir. Onlar eCSF (Şekil 1B vs C) yoksun olarak beyin ventriküller yıkılmıştır. Olarak dorsal görüntüleri (Şekil 1B-C ve Şekil 2A-B) arka beyin nöroepitelyumda karakteristik morfolojisi korumak yapar ve sağlam menteşe noktaları olasılığı nedeniyle eCSF olmamasına rağmen açık görünüyor. Görülen Ancak, yan görünümleri (Şekil 2A'-D ...

Tartışmalar

El ile zebrafish beyin ventriküllerden eCSF boşaltmak için bu tekniğin kullanılması, gelişme sırasında eCSF için ihtiyaç belirlenmesi için yararlı olacaktır. Buna ek olarak, bu teknik embriyonik gelişme boyunca eCSF protein profili açıklamasına izin verir. Bu süre boyunca farklı proteinin tanımlanması BOS ve beyin gelişimi sırasında potansiyel rolünün işlevinin içine daha fazla araştırma sağlayacaktır. Amniotları yılında eCSF (IGF2 FGF2, retinoik asit ve apolipoproteinler) belirlenen ...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Dr Jen Gutzman, Dr Amanda Dickinson ve birçok faydalı tartışmalar ve yapıcı eleştirileri için diğer Sive laboratuvar üyeleri ve uzman balık yetiştiriciliği için Olivier Paugois özel teşekkürler.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
Eppendorf CellTram Oil Eppendorf 516 000.025
Madeni Yağ Sigma M8410
Tricaine tozu Sigma A5040
Kapiler Tüpler FHC A.Ş. 30-30-1

Referanslar

  1. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  2. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
  3. Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
  4. Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
  5. Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
  6. Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
  7. Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
  8. Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
  9. Zheng, W., Chodobski, A. . The blood-cerebrospinal fluid barrier. , (2005).
  10. Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
  11. Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
  12. Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
  13. Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
  14. Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
  15. Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
  16. Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
  17. Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
  18. Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
  19. Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, S57-S59 (2001).
  20. Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
  21. Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
  22. Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
  23. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
  24. Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
  25. Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
  26. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  27. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
  28. Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
  29. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  30. Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
  31. Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 70Geli imsel BiyolojiT pAnatomiFizyolojiZebra balBr rerioECSFn roepitelyumdabeyin ventrik ler sistemibeyinmikrocerrahihayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır