ניקוז ידני של חדרי המוח העוברי דג הזברה

Summary

אנו מציגים שיטה לאיסוף נוזל שדרה (CSF) וליצור מערכת שאין בה CSF בתוך מערכת חדרית מוח דג הזברה העוברית. זה מאפשר לבדיקה נוספת של רכב CSF והדרישה שלה במהלך התפתחות מוח העוברית.

Abstract

נוזל השדרתי (CSF) הוא נוזל עשיר חלבון מכיל בתוך החדרים במוח. היא נמצאת במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת חוליות ונמשכת לאורך כל חיים. מבוגרי CSF הוא חשב לרפד את המוח, להסיר פסולת, ולשאת ^1,2 מולקולות מופרשות. במבוגרים ומבוגרים העובר, רוב CSF נעשה על ידי דמה עין המקלעת, סדרה של אזורי הפרשת כלי דם מאוד ממוקמים סמוך למוח החללים ^3-5. בדג הזברה, דמה עין המקלעת נוצרה במלואו בשעות שלאחר ההפריה 144 (hpf) ^6. לפני זה, בעוברי החולייתנים הוא דג זברה ואחרים, כוללים עכבר, כמות משמעותית של עוברי CSF (eCSF) הוא הווה. נתונים אלה ומחקרים מראים כי בחומוס neuroepithelium היא הפרשה מוקדם בפיתוח ועלולה להיות המקור העיקרי של eCSF לפני דמה עין המקלעת ⁷ פיתוח.

eCSF מכיל בערך פי שלושה לא יותר חלבוןהאן המבוגר CSF, המצביע על כך שזה יכול להיות תפקיד חשוב במהלך הפיתוח ^8,9. מחקרים באפרוח ועכבר להוכיח כי גורמים מופרשים בeCSF, לחץ נוזל, או שילוב של אלה, הם חשובים לנוירוגנזה, ביטוי גנים, שגשוג תאים, ותא ההישרדות בneuroepithelium ^10-20. מנתח proteomic של, עכברוש אדם, עכבר, ואפרוח eCSF זיהה חלבונים רבים שעשויה להיות נחוץ לתפקוד CSF. אלה כוללים מרכיבים תאיים מטריצה, apolipoproteins, חלבוני ויסות לחץ האוסמוטי, וחלבונים מעורבים במוות של תאים והתרבות ^21-24. עם זאת, הפונקציות המורכבות של eCSF אינן ידועות.

אנחנו פתחנו שיטה להסרת eCSF מחדרים במוח דג זברה, ובכך מאפשרים לזיהוי של רכיבי eCSF ולניתוח של דרישת eCSF במהלך פיתוח. למרות שיותר eCSF ניתן לאסוף מחוליות w מערכות האחרותעוברי ith גדולים, eCSF ניתן לאסוף מהשלבים המוקדמים של פיתוח דג זברה, ובתנאים גנטיים או סביבתיים המובילים למוח נורמלי נפח חלל או במורפולוגיה. הסרה ואוסף של eCSF מאפשרות ניתוח, חקירה המונית spectrometric תפקוד eCSF, וחידוש של גורמים נבחרים לתוך חדרי הלב לבדיקת תפקודם. לכן הנגישות של עובר דג הזברה מוקדם מאפשרת ניתוח מפורט של פונקצית eCSF במהלך פיתוח.

Protocol

1. הכנת מחטי microinjection וחשמלי ניידים

1. מלא מנגנון אפנדורף CellTram שמן microinjector עם שמן מינרלים על פי הוראות היצרן.
2. הכן את מחטי microinjection ידי משייכת צינורות נימים באמצעות חולץ מחט מכשירי סאטר.
3. הר מחט על micromanipulator מחובר לאפנדורף CellTram.
4. זהירות לשבור את קצה המחט. לגודל קצה אחיד, למדוד עם מיקרומטר, או להשוות למחט הפניה.
5. מלא את אורך המחט עם שמן, שימוש CellTram לדחוף שמן לאורך, להיות זהיר, כדי למנוע בועות.

2. הכנת העוברים

1. חורים ב1% מנה מצופית agarose עם קצה פיפטה 1-200 μl, ולהסיר תקעי agarose. מלא צלחת עם תקשורת עובר (נעשה על פי ²⁵ Westerfield).
2. שימוש במלקחי עוברים, dechorionate תחת stereomicroscope.
3. העברת עוברי dechorionatedלמנה מצופית agarose.
4. להרדים עוברים, להוסיף Tricaine (0.1 מ"ג / מ"ל) למנת agarose עד עוברים מפסיקים לנוע (שנעשה על פי ²⁵ Westerfield).

3. ניקוז eCSF

1. אוריינט את העוברים בעלי הזנבות באת החורים של agarose והצדדים האחוריים שלהם הקרובים לmicromanipulator, ומאפשר הדמיה של הצד הגבי של המוח.
2. מקם את המחט בrhombomere 0/1 ציר נקודה או נקודה הרחבה ביותר של מוח אחורי חדר לב (איור 1 א).
3. זהירות צלחת גג לנקב של חלל המוח האחורי להיות בטוח שלא לעבור את העומק של המוח לחלמון.
4. מסנן את eCSF באמצעות CellTram ולאסוף נוזלים במחט microinjection. להיות זהיר, כדי למנוע את כל תאים.

4. איסוף eCSF לניתוח רכב

1. ברגע eCSF נאסף במחט, להפסיק יניקה מCellTram זהירות.
2. מוve הצלחת מתחת למחט ולמקם את המחט בזהירות לתוך מבחנה המכילה את המאגר הרצוי.
3. שימוש CellTram, לנקז eCSF מתוך המחט לחיץ מנסה להימנע מלזהם את הפתרון בשמן.
4. על מנת להסיר את התאים שיש לך ונשאף יחד עם eCSF, ספין eCSF ב -10,000 x גרם. איסוף מזוהם eCSF (supernatant) ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לניתוח נוסף.

5. חידוש של גורמים נבחרים

1. מסנן את eCSF כל 2 שעות בפרק זמן רצוי, שכן הנוזל מתחדש בתוך תקופת זמן זו. בין ניקוז בזמן נקודות, הסר את המחט ולאחסן את העוברים ב28.5 מעלות צלזיוס או רצוי טמפרטורה.
2. טען מחט micropipette שנייה עם גורם מבחן.
3. מחט למקום micromanipulator מצורפת microinjector.
4. כיוון עוצמת זריקה עד 1 nl על ידי מדידת גודל הטיפה בזמן שמן והכוון הזרקה ו-pressure.
5. להזריק 1-2 nl לחדרים במוח כפי שתוארו קודם לכן ^26.

תוצאות

דוגמה לחדר לב מוח מרוקן מוצגת באיור 1 ב-C. חדרים במוח הם התמוטטו כהם חסרים eCSF (האיור 1B לעומת C). כפי שניתן לראות בתמונות גב (איור 1B-C, ואיור 2A-D) neuroepithelium המוח האחורי עושה לשמור מורפולוגיה האופיינית ונראה שהוא פתוח למרות חוסר eCSF הנראה בשל נקודתי צ?...

Discussion

השימוש בטכניקה זו באופן ידני לניקוז eCSF מחדרים במוח דג זברה יהיה שימושי לקביעת הדרישה לeCSF במהלך פיתוח. בנוסף, טכניקה זו תאפשר תיאור של פרופיל חלבון eCSF במהלך התפתחות עוברית. זיהוי של חלבונים שונים בתקופה זו יאפשר חקירה נוספת לפונקציה של CSF והתפקיד הפוטנציאלי שלה במהלך ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגים
אפנדורף CellTram שמן	אפנדורף	516 000.025
שמן מינרלים	סיגמא	M8410
Tricaine אבקה	סיגמא	A5040
צינורות נימים	Fhc בע"מ	30-30-1