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Resumo

Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.

Resumo

Líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contidas dentro dos ventrículos do cérebro. Encontra-se presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e persiste durante toda a vida. Adulto CSF é pensado para amortecer o cérebro, remover resíduos, e proceder secretado 1,2 moléculas. No embrião de adultos e mais velhos, a maioria dos CSF é feita pelo plexo coróide, uma série de regiões altamente vascularizadas secretoras colocadas junto dos ventrículos do cérebro 3-5. No peixe-zebra, o plexo coróide está completamente formado a 144 horas pós-fertilização (hpf) 6. Antes disso, em embriões de vertebrados tanto peixe-zebra e outros, incluindo ratinho, uma quantidade significativa de embrionário CSF ​​(eCSF) está presente. Estes dados e os estudos em pintainho sugerem que o neuroepitélio é secretória precoce no desenvolvimento e pode ser a fonte principal de eCSF antes do desenvolvimento do plexo coróide 7.

eCSF contém cerca de três vezes mais proteína than adulto CSF, sugerindo que pode desempenhar um papel importante durante o desenvolvimento 8,9. Os estudos realizados em pintos e de rato demonstram que os factores secretados no eCSF, a pressão do fluido, ou uma combinação destes, são importantes para a expressão do gene neurogenesis sobrevivência, a proliferação de células, e células, no neuroepitélio 10-20. Análises proteômicas de rato, humano, mouse e eCSF garota identificaram muitas proteínas que possam ser necessárias para a função LCR. Estes incluem componentes da matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulam a pressão osmótica, e proteínas envolvidas na morte celular e proliferação 21-24. No entanto, as funções complexas do eCSF são largamente desconhecidos.

Desenvolvemos um método para a remoção de eCSF ventrículos cerebrais zebrafish, permitindo assim a identificação de componentes eCSF e para a análise do requisito eCSF durante o desenvolvimento. Embora mais eCSF podem ser coletadas de outros vertebrados sistemas wom embriões maiores, eCSF podem ser coletadas desde os primeiros estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, e sob condições genéticas ou ambientais que levam ao volume anormal do cérebro ventrículo ou morfologia. Remoção e recolha de eCSF permite a análise de espectrometria de massa de inquérito, de função eCSF, e reintrodução de factores seleccionados para os ventrículos para ensaiar a sua função. Assim, a acessibilidade do embrião do peixe-zebra precoce permite a análise detalhada da função eCSF durante o desenvolvimento.

Protocolo

1. Preparando agulhas microinjeção e Bonde celular

  1. Encha Eppendorf CellTram óleo aparelho microinjector com óleo mineral de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos.
  3. Montar a agulha na micromanipulador Eppendorf CellTram conectado.
  4. Parta cuidadosamente a ponta da agulha. Para tamanho da ponta uniforme, medir com um micrômetro, ou comparar a uma agulha de referência.
  5. Encher o comprimento da agulha com óleo, usando o CellTram para empurrar para baixo o comprimento de petróleo, tendo o cuidado para evitar as bolhas.

2. Preparando os embriões

  1. Criar buracos em uma placa de agarose a 1%, revestida com uma ponta de pipeta de 1-200 uL, e remover tampões de agarose. Preencha prato com media de embriões (feita de acordo com Westerfield 25).
  2. Utilizando uma pinça, embriões dechorionate sob estereomicroscópio.
  3. Transferência de embriões dechorionatedem agarose prato revestido.
  4. Para anestesiar os embriões, adicionar tricaina (0,1 mg / ml) ao prato de agarose até embriões parar de se mover (feito de acordo com Westerfield 25).

3. Drenagem do eCSF

  1. Orientar os embriões com as caudas dos orifícios da agarose e os seus lados posteriores mais próximos do micromanipulador, permitindo a visualização do lado dorsal do cérebro.
  2. Posicionar a agulha no rhombomere 0/1 dobradiça-ponto ou ponto mais largo do cérebro posterior esquerdo (Figura 1A).
  3. Cuidadosamente placa telhado perfurar do ventrículo rombencéfalo tendo a certeza de não passar a profundidade do cérebro para a gema.
  4. Drenar o eCSF usando o CellTram e recolher fluido na agulha de microinjecção. Tenha cuidado para evitar quaisquer células.

4. Coletar a eCSF para análise de composição

  1. Uma vez que o eCSF é recolhida na agulha, cuidadosamente parar de aspiração do CellTram.
  2. Move o prato para fora sob a agulha e posicionar a agulha com cuidado para um tubo que contém o tampão desejado.
  3. Usando o CellTram, drenar o eCSF para fora da agulha para o buffer de tentar evitar a contaminação da solução com óleo.
  4. A fim de eliminar as células que tenham aspirado juntamente com o, eCSF rotação eCSF a 10.000 x g. Colete contaminada eCSF (sobrenadante) e armazenar a -80 ° C até estar pronto para análise posterior.

5. Reintrodução de fatores selecionados

  1. Drenar o eCSF cada 2 horas durante o intervalo de tempo desejado, uma vez que o líquido é alimentado dentro desse período de tempo. Entre os pontos de tempo de drenagem, retire a agulha e armazenar os embriões a 28,5 ° C ou a temperatura desejada.
  2. Carregar agulha micropipeta segundo com factor de teste.
  3. Agulha lugar em micromanipulador ligado a microinjetor.
  4. Ajustar o volume de injecção de 1 nl medindo o tamanho da gota de óleo e ajustamento do tempo de injecção e pressure.
  5. Injetar 1-2 NL em ventrículos cerebrais, como descrito anteriormente 26.

Resultados

Um exemplo de um ventrículo cerebral drenado é mostrado na Figura 1B, C-. Ventrículos cerebrais são recolhidos como falta eCSF (Figura 1B vs C). Como se vê nas imagens dorsal (Figura 1B-C, e A Figura 2A-D) do neuroepitélio rombencéfalo retém a sua morfologia característica e parece ser aberta, apesar da falta de eCSF provavelmente devido à robustas dobradiças-pontos. No entanto, vistas laterais (Figura 2A'-D ") demon...

Discussão

A utilização desta técnica para drenar manualmente eCSF de ventrículos cerebrais zebrafish será útil para a determinação da exigência de eCSF durante o desenvolvimento. Além disso, esta técnica permite a descrição do perfil proteico eCSF ao longo do desenvolvimento embrionário. Identificação de proteínas diferentes durante este tempo irá permitir uma investigação mais aprofundada sobre a função do LCR e o seu papel potencial durante o desenvolvimento do cérebro. No amniotas, alguns factores identi...

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Um agradecimento especial ao Dr. Jen Gutzman, Amanda Dr. Dickinson e outros membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e Olivier Paugois para criação de peixes especialista.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
Eppendorf CellTram óleo Eppendorf 516 000.025
Óleo mineral Sigma M8410
Tricaina pó Sigma A5040
Tubos capilares FHC Inc. 30-30-1

Referências

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  2. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
  3. Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
  4. Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
  5. Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
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