JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод сбора спинномозговой жидкости (ликвора), а также создать систему, которая испытывает недостаток CSF в эмбриональном системе желудочков мозга рыбок данио. Это позволяет для дальнейшего рассмотрения CSF состав и требования во время эмбрионального развития головного мозга.

Аннотация

Спинномозговой жидкости (ликвора) представляет собой белок, богат жидкости, содержащейся в желудочки мозга. Он присутствует во время раннего эмбрионального развития позвоночных и сохраняется на протяжении всей жизни. Взрослые CSF, как полагают, чтобы смягчить мозга, удаление отходов, а также осуществлять выделяются молекулы 1,2. В эмбрион взрослого и старше, большинство из CSF производится сосудистое сплетение, ряд весьма васкуляризированной секреторных регионов, расположенных рядом с желудочки головного мозга 3-5. У рыбок данио, сосудистое сплетение полностью сформирован на 144 часов после оплодотворения (HPF) 6. До этого, в обоих рыбок данио и других эмбрионов позвоночных, включая мышь, значительное количество эмбриональных CSF (eCSF) присутствует. Эти данные и исследования на куриных предположить, что нейроэпителия является секреторным на ранней стадии развития и может быть основным источником eCSF до сосудистое сплетение развития 7.

eCSF содержит примерно в три раза больше белка тХан взрослых CSF, предполагая, что она может играть важную роль в процессе развития 8,9. Исследования, проведенные в кур и мышей показали, что выделяемые факторы в eCSF, давление жидкости, или комбинация из них, которые важны для нейрогенеза, экспрессия генов, пролиферацию клеток, и выживание клеток в нейроэпителии 10-20. Proteomic анализы человека, крысы, мыши и куриных eCSF выявили много белков, которые могут быть необходимы для функции CSF. Они включают в себя компоненты внеклеточного матрикса, аполипопротеинов, регулирующие осмотическое давление белков и белков, участвующих в клеточной гибели и пролиферации 21-24. Тем не менее, сложные функции eCSF в значительной степени неизвестны.

Мы разработали метод для удаления eCSF из желудочков мозга у рыбок данио, что позволяет для идентификации компонентов eCSF и для анализа требований eCSF в процессе разработки. Хотя более eCSF могут быть собраны из других позвоночных систем Wго больше эмбрионов, eCSF может быть собрана с самых ранних стадиях развития данио рерио, а под генетическими или экологическими условиями, которые приводят к ненормальной объема желудочков мозга или морфологии. Удаление и сбор eCSF позволяет масс-спектрометрический анализ, исследование функции eCSF, и реинтродукции выберите факторов в желудочки для анализа их функции. Таким образом, доступность ранних эмбрионов данио рерио позволяет детальный анализ функций eCSF в процессе разработки.

протокол

1. Подготовка Микроинъекция Иглы и сотовый трамвай

  1. Заполните Eppendorf CellTram нефти микроинъектор аппарат с минеральным маслом в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
  2. Подготовка микроинъекции иглы, потянув капиллярных труб с помощью инструментов Sutter иглы съемника.
  3. Установить иглу на микроманипулятора подключен к Eppendorf CellTram.
  4. Аккуратно разбить кончик иглы. Для равномерного размер чаевых, измеряют с помощью микрометра, или сравнить с эталонным иглы.
  5. Заполните длина иглы с маслом, используя CellTram нажать нефти по всей длине, будьте осторожны, чтобы избежать пузырей.

2. Подготовка эмбрионов

  1. Ткните отверстия в 1% агарозном блюдо с покрытием 1-200 мкл кончика пипетки, и удалить агарозном пробки. Заполните блюдо с эмбрионом средствах массовой информации (в соответствии с Westerfield 25).
  2. Используя щипцы, dechorionate эмбрионов под стереомикроскопа.
  3. Передача dechorionated эмбрионовв агарозном покрытием блюдо.
  4. Чтобы обезболить эмбрионов, добавить Tricaine (0,1 мг / мл), чтобы блюдо агарозы, пока эмбрионы перестали двигаться (производится в соответствии с Westerfield 25).

3. Слив eCSF

  1. Orient эмбрионов с хвостами в отверстия агарозы и их задней стороны ближе к микроманипулятора, что позволяет визуализировать спинной стороне головного мозга.
  2. Расположите иглу в ромбомеров 0/1 петля-точка или точка широкого заднего мозга желудочка (рис. 1А).
  3. Осторожно пробить крышу пластины заднего мозга желудочка будучи уверенным, что не пройти глубине мозга в желтке.
  4. Слейте eCSF помощью CellTram и собирают жидкость в микроинъекции иглы. Будьте осторожны, чтобы избежать любых клеток.

4. Сбор eCSF для анализа состава

  1. После того, eCSF собирается в иглу, осторожно остановить всасывания из CellTram.
  2. Moве блюдо из-под иглы и тщательно позиционировать иглу в пробирку, содержащую желаемый буфера.
  3. Использование CellTram, процедить eCSF из иглы в буфер пытается избежать загрязнения раствора с маслом.
  4. Для того, чтобы удалить клетки, которые вы атмосферный вместе с eCSF, спина eCSF при 10000 х г. Соберите чистых eCSF (супернатанта) и хранить при температуре -80 ° С до готовности для дальнейшего анализа.

5. Реинтродукции отдельных факторов

  1. Слейте eCSF каждые 2 часа в течение желаемого интервала времени, так как жидкость пополняется в течение этого периода времени. Между дренажных моменты времени, извлеките иглу и хранения эмбрионов при 28,5 ° C или желаемую температуру.
  2. Загрузите вторую иглу микропипетки с испытательным фактор.
  3. Место иглы в микроманипулятора прикреплены к микроинъектор.
  4. Отрегулируйте объемом впрыска до 1 NL путем измерения размера капель в масло и регулирования времени впрыска и рressure.
  5. Вводят 1-2 п в желудочки головного мозга, как описано выше 26.

Результаты

Пример осушенных желудочков мозга показано на рисунке 1B-C. Желудочков мозга свернуты, поскольку они лишены eCSF (рис. 1б и C). Как видно из спинного изображения (рис. 1B-C, и рис. 2A-D) заднего мозга нейроэпителия делает сохранить свою характерной морфологией ?...

Обсуждение

Использование этой техники вручную слить eCSF из желудочков мозга у рыбок данио будут полезны для определения потребности в eCSF в процессе разработки. Кроме того, эта методика позволит описание профиля белков eCSF в течение эмбрионального развития. Определение различных белков, в течение ?...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института психического здоровья и Национального научного фонда. Особая благодарность доктору Джен Gutzman, доктор Аманда Дикинсон и другие члены Sive лаборатории за многочисленные полезные обсуждения и конструктивной критики, и Оливье Paugois для экспертов хозяйства рыбы.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер в каталоге
Eppendorf CellTram нефти Eppendorf 516 000.025
Минеральное масло Сигма M8410
Tricaine порошок Сигма A5040
Капиллярные трубки FHC Инк 30-30-1

Ссылки

  1. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  2. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
  3. Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
  4. Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
  5. Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
  6. Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
  7. Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
  8. Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
  9. Zheng, W., Chodobski, A. . The blood-cerebrospinal fluid barrier. , (2005).
  10. Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
  11. Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
  12. Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
  13. Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
  14. Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
  15. Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
  16. Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
  17. Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
  18. Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
  19. Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, S57-S59 (2001).
  20. Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
  21. Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
  22. Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
  23. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
  24. Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
  25. Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
  26. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  27. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
  28. Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
  29. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  30. Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
  31. Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience70ECSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены