SNARE蛋白介导的膜融合酶的细胞融合含量的分析

摘要

我们已经开发出一种量化SNARE介导膜融合事件由激活的β-半乳糖苷酶的表达的细胞融合实验。

摘要

T-SNARE蛋白的相互作用的SNARE（oluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子一个的重整 ttachment蛋白受体）的目标膜蛋白在囊泡（V-SNARE蛋白）和（）催化细胞内的囊泡融合^1-4。重组分析是必不可少的解剖机制和调节SNARE蛋白介导的膜融合^5。在细胞融合实验^6,7中 ，异位SNARE蛋白表达在细胞表面。这些“翻转”SNARE蛋白驱动细胞与细胞融合，展示，网罗足够细胞膜融合。由于测定是基于微观分析的细胞融合，它是低效率的，使用时，多个的v-叔SNARE相互作用定量分析。

在这里，我们描述了一种新的检测的量化β-半乳糖苷酶的活性表达的SNARE蛋白介导的细胞融合。二在Tet-关基因表达系统^9的组件被用作读出系统：四环素控制的反式激活（tTA的）和四环素反应元件（TRE-LacZ的）的控制下，编码的LacZ基因的报道质粒。我们tTA的转染到COS-7细胞表达翻转的v-SNARE蛋白在细胞表面（的v-细胞）和TRE-LacZ基因转染到COS-7细胞表达翻转叔SNARE蛋白在细胞表面（t细胞） 。 SNAP-依赖的融合的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE，LacZ和β-半乳糖苷酶的表达的转录激活。 β-半乳糖苷酶的活性，使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度进行定量。

囊泡相关膜蛋白（VAMPS），是V-SNARE蛋白驻留在不同的后高尔基体泡状车厢^10-15。鞋面1，3，4，5，7和8，在相同的水平表达，我们比较了它们的膜融合活动中使用的酶的细胞融合实验。基于光谱测量，该法提供了一个量化的方法分析SNARE蛋白介导的膜融合，为高通量研究。

研究方案

1。细胞培养和转染

1. 补充与4.5克/升葡萄糖和10％牛胎儿血清（FBS）的Dulbecco改良的Eagle氏培养基（DMEM）中培养COS-7细胞。
2. 根据制造商的说明（Invitrogen公司），与Lipofectamine质粒转染。

2。 SNARE细胞表面表达的荧光显微分析

1. 转染前一天，3×10 ^4个 COS-7细胞接种在无菌的12毫米的盖玻片（Fisher Scientific）的24孔培养板中所载。
2. 对于v-细胞，在各孔中，0.25微克，编码tTA的质粒（pTet-关闭，CLONTECH公司）共转染的质粒表达翻转VAMPS用0.25微克。
3. 0.25微克的质粒编码TRE-LacZ的（的pBI-G，CLONTECH公司）对于t在每个孔中的细胞，用0.25微克表示翻转SNAP-25和syntaxins 1或4的每一个的质粒共转染。
4. 24小时后T转染的，固定细胞，用4％的多聚甲醛（PBS补充有0.1克/升CaCl ₂和0.1克/升的MgCl _2）10分钟，然后在10％FBS的在PBS中的阻塞，在PBS + + + + 30分钟。
5. 与抗Myc单克隆抗体9E10（纯的杂交瘤培养上清液），将细胞温育1.5小时。
6. PBS + +洗涤四次后，将细胞温育1小时，在1:500稀释的FITC标记的二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories公司）。
7. 洗涤四次后用PBS + +，标记的细胞被安装在延长Gold抗淬灭试剂（Invitrogen）。
8. 共聚焦图像采集的奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜。与Adobe Photoshop软件处理图像。

3。流式细胞仪检测细胞表面SNARE表达

1. 转染前一天，2×10 ⁵ COS-7细胞接种于6孔培养板的各孔中。
2. 24小时后，TRAnsfection与翻转圈套，pTet-Off和的pBI-G质粒，细胞被固定，用1％多聚甲醛的PBS + +的15分钟，然后在10％FBS在PBS + + 15分钟中断。
3. 将细胞孵育60分钟抗Myc单克隆抗体9E10。
4. 洗涤三次后，用PBS + +中，被标记细胞用FITC标记的二次抗体（1:200稀释），45分钟。
5. 用PBS洗涤三次后，+ +，将细胞刮下板，用细胞刮刀破碎。
6. 使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences公司），分析了15,000个细胞。使用CellQuest Pro软件得到各样品的平均荧光强度。

4。酶细胞融合含量

1. 转染前一天，1.2×10 ^6个 COS-7细胞接种于每100毫米的组织培养皿中，和2×10 ⁵ COS-7细胞接种于6孔培养板的各孔中。
2. 对于v-细胞，0.5 - 5微克每个flipp编辑VAMP质粒共转染pTet关闭到每100毫米的培养皿中的细胞用5μg。控制细胞转染空载体pcDNA3.1（+）和pTet关闭。为了防止鞋面1，4，5，7和8，衣霉素的N-糖基化的（10微克/毫升）被包括在转染细胞培养基中。
3. 对于t-细胞的6孔培养板的各孔中，1微克翻转SNAP-25质粒的pBI-G的共转染0.5μg的翻转的翻转syntaxin4质粒syntaxin1质粒或0.05微克。
4. 转染后24小时，培养皿与酶的无细胞解离缓冲液（Invitrogen）中的v-细胞脱离。剥离的细胞，用血细胞计数器计数，并再悬浮在HEPES缓冲的DMEM培养液含10％FBS，6.7微克/毫升衣霉素和0.67 1mM DTT的。
5. 4.8×10 ⁵再悬浮的v-细胞被添加到每个孔中已经含有的t-细胞。
6. 6，第12或24小时后的大鼠37℃，在5％CO _2的 中，与报告基因裂解缓冲液中使用的β-半乳糖苷酶的酶活性检测系统，根据制造商的说明书（Promega公司）测定β-半乳糖苷酶的表达。简言之，细胞用PBS洗涤两次，然后在报告裂解缓冲液裂解。含量2×缓冲液与等体积的细胞溶胞产物混合。报告裂解缓冲液作为空白对照，检测2×缓冲液混合。
7. 90分钟后，停止显色反应，通过加入1M碳酸钠。
8. 在420 nm处的吸光度测量采用日立100-40分光光度计。

结果

要制定一个定量的细胞融合实验，我们利用强有力的转录激活TTA到TRE的结合。在tTA的的情况下，转录的 LacZ基因在TRE-LacZ的是无声的。 tTA的存在时，它的TRE结合并激活的 LacZ基因的转录， 图1示出了流程图的酶的细胞融合实验。 tTA的转染到v-细胞表达的v-SNARE蛋白在细胞表面，和TRE-LacZ基因转染到t细胞，在细胞表面的表达叔SNARE蛋白。的v-和T-细胞的查询结果中?...

讨论

原细胞融合实验⁶荧光显微镜决定SNARE蛋白介导的细胞融合。在这里，我们描述了一个创新的分析，量化SNARE蛋白介导的细胞融合，通过激活β-半乳糖苷酶的表达和光谱测量。使用这个实验中，我们经常分析15 - V-20和T-SNARE组合在一个单一的实验。使用流式细胞仪来测量圈套在细胞表面的表达，我们滴定的鞋面的表达水平，并比较它们的膜融合的能力（图2和图4）。此外，使用的酶的细胞融?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂和设备名称	公司	目录号
DMEM	Invitrogen公司	12800-017
COS-7细胞	ATCC	CRL-1651
衣霉素	Sigma-Aldrich公司	T7765-5MG
pTet关闭	Clontech公司	K1620-A
PBI-G	Clontech公司	6150-1
脂质体转染法	Invitrogen公司	18324-012
酶细胞分离解决方案	Invitrogen公司	13151-014
兔抗-TET阻遏多克隆抗体	密理博	AB3541
FITC标记的驴抗小鼠IgG（H + L）	江淮KSON immunoresearch公司	715-095-150
激光扫描共聚焦显微镜	奥林巴斯	FV1000
FACSCalibur流式细胞仪	BD Biosciences公司
β-半乳糖苷酶活性检测系统的报告裂解缓冲液	Promega公司	E2000
型号100-40 UV-VIS分光光度计	日立	C740843