Análisis de la fusión de la membrana SNARE mediada usando un ensayo de fusión celular enzimática

Resumen

Hemos desarrollado un ensayo de fusión celular que cuantifica SNARE mediada por los acontecimientos de fusión de membrana por la expresión activa de β-galactosidasa.

Resumen

Las interacciones de las SNARE (s oluble N-etilmaleimida factor sensible a una proteína ttachment ceptor re) proteínas en vesículas (v-SNARE) y en membranas diana (t-SNARE) catalizan la fusión de vesículas intracelulares ^1-4. Ensayos de reconstitución son esenciales para disecar el mecanismo y la regulación de la fusión de membranas mediada por ^5-SNARE. En un ensayo de fusión celular ^6,7, las proteínas SNARE se expresan ectópicamente en la superficie celular. Estos "volteado" SNARE unidad proteínas de fusión célula-célula, lo que demuestra que trampas son suficientes para fusionar las membranas celulares. Debido a que el ensayo de fusión celular se basa en el análisis microscópico, que es menos eficiente cuando se usa para analizar múltiples interacciones y v-t-SNARE cuantitativamente.

Aquí se describe un nuevo ensayo que cuantifica ⁸ SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa. Doscomponentes del sistema de genes Tet-Off expresión ⁹ se utiliza como un sistema de lectura: el transactivador controlado por tetraciclina (tTA) y un plásmido informador que codifica el gen LacZ bajo el control del elemento de respuesta de tetraciclina (TRE-LacZ). Nos transfectar tTA en células COS-7 que expresan volteado v-SNARE proteínas en la superficie celular (V-células) y transfección de TRE-LacZ en células COS-7 que expresan volteado t-SNARE proteínas en la superficie celular (células T) . SNARE dependiente de la fusión de la V-y las células T resulta en la unión de tTA a TRE, la activación transcripcional de LacZ y la expresión de β-galactosidasa. La actividad de β-galactosidasa se cuantificó usando un método colorimétrico por absorbancia a 420 nm.

Las proteínas asociadas a la membrana de vesículas (vampiros) son v-SNARE que residen en diferentes compartimentos de Golgi post-vesiculares ^10-15. Mediante la expresión de VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 y 8 en el mismo nivel, se compara su fusión de membranasactividades utilizando el ensayo de células de fusión enzimática. Sobre la base de la medición espectrométrica, este ensayo ofrece un enfoque cuantitativo para el análisis de SNARE mediada por fusión de membranas y para estudios de alto rendimiento.

Protocolo

1. Cultivo de células y transfección

1. Células COS-7 se cultivaron en medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 4,5 g / l de glucosa y 10% de suero fetal bovino (FBS).
2. Transfección del plásmido se lleva a cabo con Lipofectamine según las instrucciones del fabricante (Invitrogen).

2. Análisis de fluorescencia microscópica de la superficie celular Expresión SNARE

1. El día antes de la transfección, 3 × 10 ⁴ células COS-7 se sembraron en cubreobjetos de vidrio estériles de 12 mm (Fisher Scientific) que figuran en placas de 24 pocillos.
2. Para V-células en cada pocillo, 0,25 g del plásmido que codifica tTA (pTet-Off, Clontech) se cotransfectaron con 0,25 g de los plásmidos que expresan volteado VAMPS.
3. Para las células T en cada pocillo, 0,25 g de plásmido que codifica la TRE-LacZ (pBI-G, Clontech) se cotransfectaron con 0,25 g de cada uno de los plásmidos que expresan volteado SNAP-25 y syntaxins 1 o 4.
4. 24 horas después de transfection, las células se fijan con 4% de paraformaldehído en PBS + + (PBS suplementado con 0,1 g / l CaCl ₂ y 0,1 g / l MgCl ₂₎ durante 10 min, y después se bloquearon en FBS al 10% en PBS + + de 30 min.
5. Las células se incubaron durante 1,5 h con las 9E10 anticuerpos monoclonales anti-Myc (sobrenadante del cultivo de hibridoma puro).
6. Después de cuatro lavados con PBS + +, las células se incubaron durante 1 h con FITC conjugado con anticuerpos secundarios (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a una dilución de 1:500.
7. Después de cuatro lavados con PBS + +, las células marcadas se montan en Prolong antifade reactivo Gold (Invitrogen).
8. Imágenes confocales se recogen en un láser confocal de barrido microscopio Olympus. Las imágenes se procesaron con el software Adobe Photoshop.

3. FACS Análisis de la expresión SNARE superficie celular

1. El día antes de la transfección, 2 × 10 ⁵ células COS-7 se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos.
2. 24 horas después del transfection con el volteado SNARE, pTet-Off y plásmidos pBI-G, las células se fijaron con paraformaldehído al 1% en PBS + + durante 15 min, y después se bloquearon en FBS al 10% en PBS + + de 15 min.
3. Las células se incubaron con los anticuerpos 9E10 monoclonales anti-Myc por 60 min.
4. Después de tres lavados con PBS + +, las células se marcan con FITC conjugado con anticuerpos secundarios (1:200 dilución) durante 45 min.
5. Después de tres lavados con PBS + +, las células se raspan de las placas con un raspador de células.
6. 15.000 células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). La intensidad media de fluorescencia de cada muestra se obtuvieron usando el software CellQuest Pro.

4. Ensayo de fusión célula enzimática

1. El día antes de la transfección, 1,2 x 10 ⁶ células COS-7 se siembran en cada placa de cultivo tisular 100-mm cultura, y 2 × 10 ⁵ células COS-7 se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos.
2. Por v-células, 0,5 - 5 mg cada una de flipped plásmido VAMP se cotransfectaron con 5 g de pTet-Off en las células en cada placa de cultivo de 100-mm. Control de las células se cotransfectaron con el vector pcDNA3.1 vacío (+) y pTet-Off. Para evitar que la N-glicosilación de VAMPS 1, 4, 5, 7 y 8, tunicamicina (10 mg / ml) se incluye en medio de cultivo celular durante la transfección.
3. Para las células T en cada pocillo de las placas 6-y, 1 g de volteado SNAP-25 plásmido pBI-G y se cotransfectan con 0,5 ug de plásmido syntaxin1 volteado o 0,05 g de volteado syntaxin4 plásmido.
4. 24 horas después de la transfección, las células en V se desprenden de las placas de cultivo con la enzima libre de disociación celular Buffer (Invitrogen). Independiente células se cuentan con un hemocitómetro y se resuspendieron en HEPES tamponada con DMEM suplementado con FBS al 10%, 6,7 mg / ml tunicamicina y 0,67 mM de DTT.
5. 4,8 × 10 ⁵ v-resuspendieron las células se añaden a cada pocillo que ya contenía las células-T.
6. Después de 6, 12 o 24 hr rata 37 ° C en 5% de CO ₂ , la expresión de β-galactosidasa se midió utilizando el sistema de enzimas β-galactosidasa de ensayo con tampón de lisis reportero de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Brevemente, las células se lavan dos veces con PBS, y después se lisaron en tampón de lisis Reporter. Los lisados ​​celulares se mezclaron con un volumen igual de tampón de ensayo × 2. Como control en blanco, el tampón de lisis Reporter se mezcla con el tampón de ensayo × 2.
7. Después de 90 min, la reacción colorimétrica se detiene mediante la adición de carbonato de sodio 1 M.
8. La absorbancia a 420 nm se midió utilizando un espectrofotómetro HITACHI 100-40.

Resultados

Para desarrollar un ensayo de fusión celular cuantitativos, se aprovecha de la fuerte activación transcripcional por la unión de tTA a TRE. En ausencia de tTA, la transcripción del gen LacZ en TRE-LacZ está en silencio. Cuando tTA está presente, se une a la TRE y activa la transcripción de lacZ. Figura 1 muestra un diagrama de flujo de la fusión de células de ensayo enzimático. tTA se transfecta en v-células que expresan v-SNARE proteínas en la superficie celular, ...

Discusión

El ensayo de células fusión original ⁶ determina mediadas SNARE-eventos de fusión de células mediante microscopía de fluorescencia. Aquí se describe un ensayo que cuantifica innovador SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa y la medición espectrométrica. Usando este ensayo, se analizan rutinariamente 15 a 20 y v-t-SNARE combinaciones en un solo experimento. Usando citometría de flujo para medir la expresión SNARE en la superficie celula...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de los reactivos y equipos	Empresa	El número de catálogo
DMEM	Invitrogen	12800-017
COS-7 células	ATCC	CRL-1651
tunicamicina	Sigma-Aldrich	T7765-5MG
pTet-Off	Clontech	K1620-A
pBI-G	Clontech	6150-1
lipofectamina	Invitrogen	18324-012
Enzima libre de células solución de disociación	Invitrogen	13151-014
De conejo anti-represor Tet anticuerpo policlonal	Millipore	AB3541
FITC-conjugado con burro anti-ratón IgG (H + L)	JacKson ImmunoResearch	715-095-150
El escaneo láser confocal microscopio	Olimpo	FV1000
FACSCalibur citómetro de flujo	BD Biosciences
β-galactosidasa sistema de ensayo con tampón de lisis reportero	Promega	E2000
Modelo 100-40 espectrofotómetro UV-VIS	Hitachi	C740843