JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали анализ слияния клеток, который количественно SNARE-опосредованных событий слияние мембран активированным выражение β-галактозидазы.

Аннотация

Взаимодействий SNARE (ы oluble N-этилмалеимид-чувствительных факторов повторного ttachment белком рецептор) белков на пузырьках (V-SNAREs) и на цели мембран (т-SNAREs) катализирует внутриклеточные везикулы слияния 1-4. Восстановление анализы имеют важное значение для рассечения механизмов и регуляции обмена SNARE-опосредованного слияния мембран 5. В анализе слияния клеток 6,7, Малый белки экспрессируются эктопически на поверхности клетки. Эти "перевернул" SNARE белков диск клетка-клетка слияния, демонстрируя, что SNAREs достаточно, чтобы слиться клеточных мембран. Поскольку анализ слияния клеток основана на микроскопическом анализе, он менее эффективен, когда используется для анализа нескольких В-и Т-SNARE взаимодействия количественно.

Здесь мы описываем новую анализа 8, что количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы. ДваКомпоненты Tet-Off экспрессии генов системы 9 используются в качестве считывания системы: тетрациклин-контролируемой трансактиватор (TTA) и репортера плазмиды, который кодирует ген LacZ под контролем тетрациклин-ответ элемент (TRE-LacZ). Мы трансфекции TTA в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернутый V-SNARE белков на поверхности клетки (В-клетки) и трансфекции TRE-LacZ в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернулся T-SNARE белков на поверхности клетки (Т-клетки) . SNARE-зависимых слияние В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE, транскрипционной активации LacZ и экспрессии β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы количественно использованием колориметрическим методом по поглощению при 420 нм.

Пузырька связанных мембранных белков (вампиры) являются V-SNAREs, которые находятся в различных пост-Гольджи везикулярного отсеков 10-15. Выражая 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8 на том же уровне, мы сравниваем их слияние мембрандеятельности с использованием ферментативного анализа слияния клеток. На основании спектрометрических измерений этого анализа предлагается количественный подход к анализу SNARE-опосредованного слияния мембран и высокой пропускной исследований.

протокол

1. Культура клеток и трансфекция

  1. COS-7 клетки культивировали в среде Игла изменения Орла (DMEM) с добавлением 4,5 г / л глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
  2. Трансфекции плазмиды делается с Lipofectamine в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Invitrogen).

2. Флуоресценция Микроскопический анализ сотовых Выражение SNARE поверхности

  1. За день до трансфекции, 3 × 10 4 COS-7 клеток высевали на стерильные 12-мм стекла покровные (Fisher Scientific), содержащийся в 24-луночных планшетах.
  2. Для V-клеток в каждой лунке, 0,25 мкг плазмиды, кодирующей TTA (pTet-Off, CLONTECH) является котрансфицировали с 0,25 мкг плазмиды, которые выражают перевернулся вампиров.
  3. Для Т-клеток в каждой лунке, 0,25 мкг плазмиды, кодирующей TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) является котрансфицировали с 0,25 мкг каждой из плазмид, которые выражают перевернулся SNAP-25 и syntaxins 1 или 4.
  4. Через 24 часа после тransfection, клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS + + (PBS дополнена 0,1 г / л CaCl 2 и 0,1 г / л MgCl 2) в течение 10 мин, а затем блокируется в 10% FBS в PBS + + в течение 30 мин.
  5. Клетки инкубируют в течение 1,5 часа с анти-Myc моноклональных антител 9Е10 (чистый культуре супернатанта гибридомы).
  6. После четырех промывок PBS + +, клетки инкубировали в течение 1 часа с FITC-конъюгированные вторичные антитела (Jackson Immunoresearch Laboratories) в разведении 1:500.
  7. После четырех промывок PBS + +, меченых клеток установлены в Продли Золотой antifade реагента (Invitrogen).
  8. Конфокальная изображений, собранных на лазерном Olympus сканирующей конфокальной микроскопии. Изображения обрабатываются с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop.

3. FACS анализ сотовых Выражение SNARE поверхности

  1. За день до трансфекции, 2 × 10 5 COS-7 клетки высевают в каждую лунку 6-луночных планшетах.
  2. Через 24 часа после траnsfection с перевернулся SNARE, pTet-Off и PBI-G плазмиды, клетки фиксировали 1% параформальдегидом в PBS + + в течение 15 мин, а затем блокируется в 10% FBS в PBS + + в течение 15 мин.
  3. Клетки инкубировали с анти-Myc моноклональных антител 9Е10 в течение 60 мин.
  4. После трех промывок PBS + +, клетки помечены FITC-конъюгированных вторичных антител (1:200 разведение) в течение 45 мин.
  5. После трех промывок PBS + +, клетки соскабливают плит с сотовым скребком.
  6. 15000 клеток анализировали с помощью цитометра FACSCalibur потока (BD Biosciences). Средняя интенсивность флуоресценции каждого образца, полученные с использованием CellQuest Pro программное обеспечение.

4. Ферментативный анализ слияния клеток

  1. За день до трансфекции, 1,2 × 10 6 COS-7 клетки высевают в каждой 100-мм блюдо культуры ткани, и 2 × 10 5 COS-7 клетки высевают в каждую лунку 6-луночных планшетах.
  2. Для V-клеток, 0,5 - 5 мкг каждого из flippред VAMP плазмиды котрансфицировали с 5 мкг pTet-офф в клетках в каждой 100-мм культуры блюдо. Управление клетки котрансфицировали с пустой вектор pcDNA3.1 (+) и pTet-офф. Для предотвращения N-гликозилирования из 1 вампиров, 4, 5, 7 и 8, tunicamycin (10 мкг / мл), входит в культуру клеток среды при трансфекции.
  3. Для Т-клеток в каждую лунку 6-луночные планшеты, 1 мкг перевернулся SNAP-25 плазмиды и PBI-G являются котрансфицировали с 0,5 мкг перевернулся syntaxin1 плазмиды или 0,05 мкг перевернулся syntaxin4 плазмиды.
  4. Через 24 часа после трансфекции, V-клетки отделяются от культуры блюд с ферментом без клеточная диссоциация буфер (Invitrogen). Отдельный клетки считаются с гемацитометре и ресуспендировали в HEPES-буфера DMEM с добавлением 10% FBS, 6,7 мкг / мл tunicamycin и 0,67 мМ DTT.
  5. 4,8 × 10 5 ресуспендировали V-клеток в каждую лунку добавляют, уже содержащий Т-клеток.
  6. После 6, 12 или 24 часа в сутки крыса 37 ° С в 5% СО 2 , выражение β-галактозидазы измеряется с помощью β-галактозидазы ферментов тест-системы с корреспондентом буфера для лизиса в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Promega). Короче говоря, клетки дважды промывали PBS, а затем лизируют в буфере для лизиса Reporter. Клеточные лизаты смешивают с равным объемом Анализ 2 × буфера. В пустой управления, буфер Reporter Лизис смешивается с Пробирной 2 × буфера.
  7. Через 90 мин, колориметрические реакцию останавливают добавлением 1 М карбоната натрия.
  8. Поглощение при 420 нм измеряют с помощью HITACHI 100-40 спектрофотометр.

Результаты

Для разработки количественного анализа слияния клеток, мы воспользуемся сильной активации транскрипции путем связывания TTA, чтобы TRE. В отсутствие TTA, транскрипцию гена LacZ в TRE-LacZ молчит. Когда TTA присутствует, он связывается с TRE и активирует транскрипцию LacZ. Рисунке 1

Обсуждение

Оригинальный анализ слияния клеток 6 определяет SNARE-опосредованных событий слияние клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы опишем инновационного анализа, который количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы и...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа поддерживается запуск средств из Университета Луисвилл и CA135123 из Национальных институтов здравоохранения (CH).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагентов и оборудования Компания Номер в каталоге
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 клеток ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-
PBI-G Clontech 6150-1
липофектамина Invitrogen 18324-012
Фермент без клеточная диссоциация решения Invitrogen 13151-014
Кролик анти-TET Repressor поликлональных антител Millipore AB3541
FITC-конъюгированные осла анти-мышиных IgG (H + L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Олимп FV1000
FACSCalibur проточной цитометрии BD Biosciences
β-галактозидазы ферментов тест-системы с корреспондентом буфера для лизиса Promega E2000
Модель 100-40 UV-VIS спектрофотометр Hitachi C740843

Ссылки

  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

68SNAREVAMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены