효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

요약

우리는 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 막 퓨전 이벤트를 단정 지을 세포 융합 분석을 개발했습니다.

초록

스네어 (들 oluble N-ethylmaleimide에 민감한 요소 ttachment 단백질 재를 ceptor) 소포 (V-그물)에 및 대상 멤브레인에 단백질의 상호 작용 (T-올무) 세포 소포의 융합 ^1-4 catalyze. Reconstitution의 assays는 올무로 인한 막 융합 ^(5)의 체계 및 규정을 해부에 필수적입니다. 세포 융합 분석 ^6,7에서 스네어 단백질은 세포 표면에 ectopically 표현됩니다. 이러한 올무가 세포 세포막을 융합하기에 충분한 것으로 입증, 스네어 단백질 드라이브 세포 세포 융합 "을 뒤집힌." 세포 융합 분석은 현미경 분석을 기반으로하기 때문에 여러 V-와 t-올무 상호 작용 양적 분석하는 데 사용하면 덜 효율적이다.

여기 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을만한 새로운 검정 ⁸ 설명합니다. 두테트라 사이클린 제어 transactivator (TTA) 및 테트라 사이클린 - 응답 요소의 제어 (트레 - LacZ)에서 LacZ 유전자를 인코딩 플라스미드 기자 : Tet 오프 유전자 발현 시스템 ^9의 구성 요소는 판독 시스템으로 사용됩니다. 익스프레스 익스프레스는 세포 표면에 t-올무 단백질을 뒤집은 것이 COS-7 세포 (T-세포)로 세포 표면의 V-스네어 단백질 (V-세포)와 transfect 트레 - LacZ를 뒤집힌 것을 COS-7 세포에 우리 transfect TTA . 트레 전사 LacZ의 활성화 및 β-갈 락토 표현에 TTA의 바인딩의 V-및 T-세포 결과의 올무에 의존 융합. β-갈 락토의 활동은 420 nm의에서 흡수하여 colorimetric 방법을 사용하여 정량하고 있습니다.

소포 - 관련 막 단백질 (VAMPs)는 다양한 사후 Golgi 기공을 갖는 구획에 ^10-15을 거주 V-올무 있습니다. 동일한 수준의 VAMPs 1, 3, 4, 5, 7, 8을 표현함으로써, 우리는 막 융합을 비교효소 세포 융합 분석을 사용하여 활동. spectrometric 측정을 바탕으로,이 분석은 스네어로 인한 막 융합을 분석 및 높은 처리량을 연구 양적 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 Transfection

1. COS-7 세포는 4.5 g / L 포도당와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 Dulbecco 수정일 독수리의 중간 (DMEM)에서 배양되어 있습니다.
2. 플라스미드 transfection는 제조업체의 지시 사항 (Invitrogen)에 따라 Lipofectamine하여 이루어집니다.

2. 세포 표면 스네어의 표현의 형광 미세 분석

1. transfection 전날, 3 × 10 ⁴ COS-7 세포는 24 잘 플레이트에 포함 된 멸균 12 mm 유리 coverslips (피셔 과학)에 놓는 있습니다.
2. TTA을 인코딩 그 플라스미드의 각 잘, 0.25 μg의 V-세포의 경우 (pTet 오프, CLONTECH) Express는 VAMPs을 뒤집은하는 plasmids의 0.25 μg과 cotransfected 있습니다.
3. 각 잘에 t-세포를 들어, 플라스미드 인코딩 트레 - LacZ (pBI-G, CLONTECH)의 0.25 μg는 0.25 μg 익스프레스 SNAP-25와 syntaxins 1 4 뒤집힌있는 plasmids의 각을 cotransfected 있습니다.
4. t 후 24 시간ransfection, 세포는 PBS에 4 % paraformaldehyde + + 10 분에 (PBS는 0.1 g / L CaCl _2, 0.1 g / L MgCl ₂ 보충) 한 다음 PBS에서 10 % FBS에서 차단 + + 30 분에 고정되어 있습니다.
5. 세포는 안티 - Myc 단클론 항체 9E10 (깔끔한 하이 브리 도마 문화 표면에 뜨는)에 1.5 시간에 incubated 수 있습니다.
6. 4 개의 세차 후 PBS + +, 셀 1:500의 희석에 FITC-복합 차 항체 (잭슨 Immunoresearch 연구소)와 1 시간에 incubated 수 있습니다.
7. 4 개의 세차 후 PBS + +, 레이블 셀 골드 antifade 시약 (Invitrogen)를 연장으로 장착되어 있습니다.
8. 공 촛점 이미지는 올림푸스 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경에서 수집됩니다. 이미지는 어도비 포토샵 소프트웨어로 처리됩니다.

3. 세포 표면 올무 식의 FACS 분석

1. transfection 전날, 2 × 10 ⁵ COS-7 세포는 6 잘 플레이트의 각 우물에 놓는 있습니다.
2. tra 후 24 시간과 nsfection은 스네어, pTet 오프 및 pBI-G의 plasmids, 방석을 뒤집은 세포는 PBS에 1 % paraformaldehyde와 + + 15 분에 고정하고 PBS에서 10 % FBS에서 + + 15 분에 차단됩니다.
3. 세포는 60 분에 반 Myc 단클론 항체 9E10와 incubated 수 있습니다.
4. 든 세 세차 후 PBS + +, 셀이 45 분에 FITC-복합 차 항체 (1:200 희석)으로 분류됩니다.
5. PBS 든 세 세차는 + +, 세포는 세포 스크레이퍼로 접시에서 긁어 후.
6. 15000 세포는 FACSCalibur 흐름 cytometer (BD Biosciences)를 사용하여 분석하고 있습니다. 각 샘플의 평균 형광 강도는 CellQuest Pro 소프트웨어를 사용하여 얻어진다.

4. 효소 세포 융합 분석

1. transfection 전날, 1.2 × 10 ⁶ COS-7 세포는 각각 100 mm 조직 배양 접시에 놓는, 그리고 2아르 × 10 ⁵ COS-7 세포는 6 잘 플레이트의 각 우물에 놓는 있습니다.
2. 5 μg flipp의 각 - V-세포, 0.5에 대한플라스미드 에드 즉석 반주는 각 100 mm 배양 접시에있는 세포에 pTet 오프 5 μg과 cotransfected 있습니다. 제어 세포는 빈 벡터 pcDNA3.1 (+)와 pTet 오프로 cotransfected 있습니다. VAMPs 1, 4, 5, 7, 8, tunicamycin의 N-글리코 실화를 방지하기 위해 (10 μg / ml) 쇼핑은 transfection시 세포 배양 매체에 포함되어 있습니다.
3. 6 잘 플레이트의 각 잘에 t-세포의 경우, 1 μg은 SNAP-25 플라스미드를 뒤집힌 및 pBI-G는 0.5 μg과 cotransfected 아르는 플라스미드 syntaxin4을 뒤집은의 플라스미드 syntaxin1 또는 0.05 μg을 뒤집어 졌죠.
4. 24 시간 transfection 후, V-세포는 효소가없는 세포 분리 버퍼 (Invitrogen)와 문화 요리에서 분리됩니다. 단독 세포가 hemacytometer로 간주하고에 resuspended 아르 HEPES 버퍼 DMEM 10 % FBS, 6.7 μg / ML의 tunicamycin 및 0.67 밀리미터 DTT와 함께 보충.
5. 4.8 × resuspended 10 ⁵ V-셀은 각도 이미 t-세포를 포함에 추가됩니다.
6. 6, 12 시간 또는 24 시간 쥐 37 이후 ° C 5 % CO ₂ 에서 β-갈 락토의 표현은 제조업체의 지침 (Promega)에 따라 리포터 용해 버퍼와 β-갈 락토 효소 분석 시스템을 사용하여 측정된다. 간단히, 세포는 PBS로 두 번 세척 된 다음 리포터 용해 버퍼에 lysed. 세포 lysates는 분석이 × 버퍼의 동등한 볼륨과 혼합되어 있습니다. 빈 컨트롤으로, 리포터 용해 버퍼는 분석이 × 버퍼과 혼합되어 있습니다.
7. 90 분 후, colorimetric 반응은 1 M 나트륨 탄산을 추가하여 중지됩니다.
8. 420 나노 미터의 흡광도는 히타치 100-40 분광 광도계를 사용하여 측정된다.

결과

양적 세포 융합 분석을 개발하기 위해, 우리는 트레에 TTA의 바인딩에 의해 강한 전사 활성을 활용할 수 있습니다. TTA의 부재에서, 트레-LacZ에 LacZ 유전자의 전사는 침묵입니다. TTA가 존재하면, 트레에 바인딩와 LacZ의 전사를 활성화합니다. 그림 1은 효소 세포 융합 분석의 순서도를 보여줍니다. TTA는 세포 표면의 특급 V-스네어 단백질, 그리고 트레 - LacZ가 T-세포로 t...

토론

원래 세포 융합 분석 ⁶ 형광 현미경으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 결정합니다. 여기 β-갈 락토 및 spectrometric 측정의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을 혁신적인 분석을 설명합니다. 이 분석을 사용하여, 우리는 정기적으로 15 분석 - 20 V-와 t-올무 한 실험에서 조합. 세포 표면에 올무 식을 측정하는 유동 세포 계측법을 사용하여, 우리는 VAMPs의 표현 수준을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 및 장비 명	회사	카탈로그 번호
DMEM	Invitrogen	12800-017
COS-7 세포	ATCC	CRL-1651
tunicamycin	시그마 - 알드리치	T7765-5MG
pTet 오프	Clontech	K1620-A
pBI-G	Clontech	6150-1
lipofectamine	Invitrogen	18324-012
효소가없는 세포 분리 솔루션	Invitrogen	13151-014
토끼 반 TET 억제 polyclonal 항체	Millipore	AB3541
FITC - 복합 당나귀 안티 - 마우스 IgG (H + L)	Jackson의 ImmunoResearch	715-095-150
레이저 스캐닝 공 촛점 현미경	하늘	FV1000
FACSCalibur 흐름 cytometer	BD Biosciences
리포터의 용해 버퍼와 β-갈 락토 효소 분석 시스템	Promega	E2000
모델 100-40 UV-VIS 분광 광도계	히타치	C740843