Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay

Zusammenfassung

Wir haben eine Zellfusion Assay, SNARE-vermittelte Membranfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase entwickelt.

Zusammenfassung

Die Interaktionen von SNARE (s oluble N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor a ttachment Protein re Rezeptor)-Proteine ​​auf Vesikeln (v-SNARE) und Zielmembranen (t-SNAREs) katalysieren intrazellulären Vesikelfusion ^1-4. Rekonstitution Assays sind für Sezieren des Mechanismus und Regulation des SNARE-vermittelte Membranfusion ^5. In einer Zellfusion Assay ^6,7 sind SNARE-Proteine ​​ektopisch an der Zelloberfläche exprimiert wird. Diese "umgedreht" SNARE-Proteine ​​Laufwerk Zell-Zell-Fusion, die belegen, dass SNAREs ausreichen, um Zellmembranen fusionieren werden. Weil der Zellfusion Assay auf mikroskopische Analyse basiert, ist es weniger effizient, wenn verwendet, um mehrere v-und t-SNARE Wechselwirkungen quantitativ zu analysieren.

Hier beschreiben wir einen neuen Assay ^8, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase. Zweidas Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator (tTA) und ein Reporterplasmid, das die LacZ-Gen unter Kontrolle des Tetracyclin-Response-Element (TRE-LacZ) kodiert: Komponenten des Tet-Off Genexpressionssystem ⁹ sind als eine Auslese-System verwendet. Wir transfizieren tTA in COS-7 Zellen, die umgedreht V-SNARE-Proteine ​​auf der Zelloberfläche (v-Zellen) und transfizieren TRE-LacZ in COS-7 Zellen, die umgedreht T-SNARE-Proteine ​​auf der Zelloberfläche (t-Zellen) . SNARE-abhängigen Fusion der v-und t-Zellen führt zur Bindung von tTA an TRE, die transkriptionale Aktivierung von LacZ und Expression von β-Galactosidase. Die Aktivität von β-Galactosidase wird quantifiziert unter Verwendung eines kolorimetrischen Verfahren durch Absorption bei 420 nm auf.

Die Vesikel-assoziiertes Membranproteine ​​(Vamps) sind v-SNAREs, die in verschiedenen Post-Golgi vesikulären Kompartimenten befinden ^10-15. Durch Expression VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 und 8 auf dem gleichen Niveau, zu vergleichen wir ihre MembranfusionAktivitäten unter Verwendung des enzymatischen Zellfusion Assay. Basierend auf spektrometrische Messung, bietet dieser Test einen quantitativen Ansatz zur Analyse von SNARE-vermittelte Membranfusion und für High-Throughput-Studien.

Protokoll

Ein. Zellkultur und Transfektion

1. COS-7-Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g / l Glukose und 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war.
2. Plasmid Transfektion mit Lipofectamin nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) durchgeführt.

2. Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Zelloberfläche SNARE Expression

1. Am Tag vor der Transfektion wurden 3 x 10 ⁴ COS-7-Zellen werden auf 12-mm sterilen Deckgläschen (Fisher Scientific) in 24-well Platten ausgesät enthalten.
2. Für v-Zellen in jedem Well, 0,25 ug des Plasmids, das tTA kodiert (pTet-Off, CLONTECH) mit 0,25 ug der Plasmide, dass ausdrückliche umgedreht Vamps kotransfiziert.
3. Für T-Zellen in jedem Well wird 0,25 ug des Plasmids, das TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) mit 0,25 ug jedes der Plasmide, dass ausdrückliche umgedreht SNAP-25 und syntaxins 1 oder 4 kotransfiziert.
4. 24 Stunden nach transfection, Zellen werden mit 4% Paraformaldehyd in PBS + + 10 min (PBS mit 0,1 g / _l CaCl2 und 0,1 g / l MgCl ₂ ergänzt), und dann in 10% FBS in PBS blockiert + + 30 min fixiert.
5. Die Zellen werden 1,5 h mit den anti-Myc monoklonalen Antikörper 9E10 (neat Hybridomkulturüberstand) inkubiert.
6. Nach vier Waschungen mit PBS + + werden die Zellen für 1 Stunde mit FITC-konjugierten Sekundärantikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1:500, inkubiert.
7. Nach vier Waschungen mit PBS + +, die markierten Zellen werden in Prolong Gold-antifade Reagenz (Invitrogen) montiert ist.
8. Konfokale Bilder werden auf einer Olympus Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop gesammelt. Die Bilder werden mit dem Adobe Photoshop-Software verarbeitet.

3. FACS Analyse der Zelloberfläche SNARE Expression

1. Am Tag vor der Transfektion 2 × 10 ⁵ COS-7-Zellen werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platten ausgesät.
2. 24 Stunden nach transfection mit der aufgeklappten SNARE, pTet-Off und pBI-G Plasmiden werden die Zellen mit 1% Paraformaldehyd in PBS + + für 15 min fixiert und dann in 10% FBS in PBS + + 15 min blockiert.
3. Die Zellen werden mit den anti-Myc monoklonalen Antikörper 9E10 für 60 min inkubiert.
4. Nach dreimaligem Waschen mit PBS + + werden die Zellen mit FITC-konjugierten sekundären Antikörpern (Verdünnung 1:200) 45 min bezeichnet.
5. Nach dreimaligem Waschen mit PBS + + werden die Zellen von den Platten mit einem Zellenabstreifer abgeschabt.
6. 15.000 Zellen werden mit Hilfe eines FACSCalibur Durchflußzytometer (BD Biosciences). Die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Probe wird unter Verwendung der CellQuest Pro Software.

4. Enzymatische Cell Fusion Assay

1. Am Tag vor der Transfektion 1,2 × 10 ⁶ COS-7-Zellen werden in jede 100-mm-Gewebekulturschalen Schale überimpft und 2 × 10 ⁵ COS-7-Zellen werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platten ausgesät.
2. Für v-Zellen, 0,5 - 5 ug jeder flipped VAMP Plasmid wird mit 5 pg von pTet-Ab in den Zellen in jeder 100-mm-Kulturschale cotransfiziert. Kontrollzellen mit dem leeren Vektor pcDNA3.1 (+) und pTet-Off cotransfiziert. Um die N-Glykosylierung von VAMPS 1, 4, 5, 7 und 8, Tunicamycin verhindern (10 ug / ml) in Zellkulturmedium während der Transfektion eingeschlossen.
3. Für T-Zellen in jedem Well der 6-Well-Platten, blätterte 1 pg SNAP-25-Plasmid und pBI-G mit 0,5 ug kotransfiziert umgedreht Syntaxin1 Plasmid oder 0,05 ug umgedreht syntaxin4 Plasmid.
4. 24 Stunden nach der Transfektion werden die v-Zellen von Kulturschalen mit der enzymfreien Zelldissoziation Buffer (Invitrogen) abgenommen ist. Abgelösten Zellen werden mit einem Hämozytometer gezählt und in HEPES-gepufferter DMEM mit 10% FBS, 6,7 ug / ml Tunicamycin und 0,67 mM DTT ergänzt.
5. 4,8 × 10 ⁵ resuspendiert v-Zellen werden in jede Vertiefung bereits mit den T-Zellen zugegeben.
6. Nach 6, 12 oder 24 hr rat 37 ° C in 5% CO ₂ die Expression von β-Galactosidase unter Verwendung des β-Galactosidase-Enzym-Assay-System mit Reporter-Lysepuffer nach den Anweisungen des Herstellers (Promega). Kurz gesagt werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, und dann in der Reporter-Lysepuffer lysiert. Zelllysate werden mit gleichen Volumen von 2 × Assay Puffer gemischt. Als Blindprobe wird der Reporter-Lysepuffer mit dem Assay 2 × Puffer gemischt.
7. Nach 90 min wird die kolorimetrische Reaktion durch Zugabe von 1 M Natriumcarbonat gestoppt.
8. Die Absorption bei 420 nm wird mit einem HITACHI 100-40 Spektralphotometer.

Ergebnisse

Um eine quantitative Zellfusion Assay zu entwickeln, nutzen wir die starke Aktivierung der Transkription durch die Bindung von tTA an TRE. In Abwesenheit von tTA ist Transkription des LacZ-Gens in TRE-LacZ still. Wenn tTA vorhanden ist, bindet es an den TRE und aktiviert die Transkription der LacZ. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der enzymatischen Zellfusion Assay. tTA in v-Zellen transfiziert, die Ausdruck v-SNARE-Proteine ​​auf der Zelloberfläche und TRE-LacZ

Diskussion

Das Originalbild Zellfusion Assay ⁶ bestimmt SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse durch Fluoreszenzmikroskopie. Hier beschreiben wir eine innovative Assay, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase und spektrometrische Messung. Unter Verwendung dieses Tests analysieren wir routinemäßig 15-20 v-und t-SNARE-Kombinationen in einem einzigen Experiment. Mittels Durchflusszytometrie zur SNARE-Expression auf der Zelloberfläche zu messen, zu titrieren wir d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namen von Reagenz und Ausrüstung	Firma	Katalognummer
DMEM	Invitrogen	12800-017
COS-7-Zellen	ATCC	CRL-1651
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-5MG
pTet-Off	Clontech	K1620-A
pBI-G	Clontech	6150-1
Lipofectamin	Invitrogen	18324-012
Enzymfreien Zelldissoziationslösung	Invitrogen	13151-014
Kaninchen anti-tet Repressor polyklonalen Antikörpers	Millipore	AB3541
FITC-konjugiertem Esel-anti-Maus-IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-095-150
Laser Scanning konfokalen Mikroskop	Olymp	FV1000
FACSCalibur Durchflusszytometer	BD Biosciences
β-Galactosidase-Enzym-Assay-System mit Reporter Lysis Buffer	Promega	E2000
Modell 100-40 UV-VIS Spektralphotometer	Hitachi	C740843