酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

要約

我々は、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介膜融合事象を定量化細胞融合アッセイを開発した。

要約

スネアの相互作用（S oluble N-エチルマレイミド感受性因子ttachmentタンパク質再受容体）小胞（V-スネア）とターゲット膜上のタンパク質（T-スネア）は細胞内の小胞融合^1-4を触媒する。再構成アッセイは、SNARE媒介膜融合⁵のメカニズムと規制を解剖するために不可欠です。細胞融合アッセイ^6,7においては、SNAREタンパク質は細胞表面で異所的に発現されています。これらは、スネアが細胞膜を融合させるのに十分であることを実証し、SNAREタンパク質ドライブ細胞 - 細胞融合を "フリップ"。細胞融合アッセイを顕微鏡分析に基づいているため、複数のV-及びt-SNARE相互作用を定量的に分析するために使用された場合、それはあまり効率的である。

ここでは、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介細胞融合事象を定量化する新しいアッセイ^8を説明^します 。 2テトラサイクリン制御トランス（TTA）とテトラサイクリン応答エレメントの制御（TRE-lacZ）を下にLacZ遺伝子をコードするプラスミドレポーター：テトオフ遺伝子発現システム⁹の構成要素は、読み出しシステムとして使用されています。エクスプレスは、細胞表面にT-SNAREタンパク質をひっくり返しているCOS-7細胞（T細胞）に、細胞表面でのv-SNAREタンパク質（V-細胞）およびトランスフェTRE-LacZを反転しているCOS-7細胞に我フェTTA 。 TRE、LacZおよびβ-ガラクトシダーゼの発現の転写活性化にTTAの結合におけるv-及びt-細胞の結果、SNARE依存の融合。 β-ガラクトシダーゼの活性は、420 ​​nmの吸光度比色法を用いて定量する。

小胞関連膜タンパク質（VAMPS）は、様々なポストゴルジ小胞のコンパートメント^10-15に存在するV-スネアです。同じレベルでVAMPS 1、3、4、5、7と8を発現することによって、我々は彼らの膜融合を比較酵素による細胞融合アッセイを使用して活動。分光測定に基づいて、このアッセイは、SNARE媒介膜融合を分析するための、高スループットの研究のための定量的なアプローチを提供しています。

プロトコル

1。細胞培養およびトランスフェクション

1. COS-7細胞は、4.5 g / Lグルコース、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養される。
2. プラスミドのトランスフェクションは、製造業者の指示（Invitrogen社）によるとリポフェクタミンを使用して行われます。

2。細胞表面のSNARE式の蛍光顕微鏡分析

1. トランスフェクションの前日、3×10 ^4、COS-7細胞を24ウェルプレートに含まれている無菌12mmのカバーグラス（フィッシャー·サイエンティフィック）上に播種する。
2. 各ウェル中のV-細胞については、TTA（PTETオフ、Clontech）をコードするプラスミド0.25μgのは急行がVAMPSをひっくり返しているプラ​​スミド0.25μgのコトランスフェクトされています。
3. 各ウェル中のT細胞は、コードするプラスミド、TRE-LacZを（PBI-G、クロンテック社）の0.25μgを0.25μgの急行は、SNAP-25およびsyntaxins 1または4をひっくり返している各プラスミドと共トランスフェクトされています。
4. トン24時間後ransfection、細胞を+ +で30分間、10分間PBS + +（PBSは0.1g / LのCaCl ₂を補充し、0.1グラム/リットルのMgCl _2）中の4％パラホルムアルデヒドで固定した後、PBS中10％FBS中でブロックされます。
5. 細胞を抗Mycモノクローナル抗体9E10（ニートハイブリドーマ培養上清）で1.5時間インキュベートする。
6. 後PBSで4回洗浄+ +は、細胞を1:500の希釈でFITC結合二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）で1時間インキュベートする。
7. 後PBSで4回洗浄+ +は、標識された細胞は、延長でGold退色防止試薬（Invitrogen）を装着されている。
8. 共焦点画像は、オリンパスのレーザー走査共焦点顕微鏡で収集されます。画像はAdobe Photoshopソフトウェアで処理されます。

3。細胞表面のSNARE発現のFACS分析

1. トランスフェクションの前日、2×10 ^5個の COS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。
2. TRA 24時間後とnsfection、スネア、PTETオフとPBI-Gプラスミドを反転し、細胞をPBSで1％パラホルムアルデヒド+ +で15分間固定した後、PBS中10％FBS + +で15分間ブロックされます。
3. 細胞は、60分間抗Mycモノクローナル抗体9E10と共にインキュベートする。
4. した後、PBSで3回洗浄+ +は、細胞を45分間、FITC標識二次抗体（1:200希釈）で標識されています。
5. PBSで3回洗浄+ +は、細胞をセルスクレーパーでプレートを掻きされた後。
6. 15000セルがFACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて分析される。各サンプルの平均蛍光強度は、CellQuest Proソフトウェアを使用して取得されます。

4。酵素的細胞融合アッセイ

1. トランスフェクションの前日に、1.2×10 ^6個の COS-7細胞をそれぞれ100 mm組織培養ディッシュに播種され、2×10 ^5個の COS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。
2. 5μgのflippの各 - V-セル、0.5プラスミドED VAMPは、それぞれ100mmの培養皿で細胞へPTETオフ5μgのコトランスフェクトされています。コントロール細胞は、空ベクターpcDNA3.1（+）とPTETオフで同時トランスフェクトされています。 VAMPS 1、4、5、7、8、ツニカマイシンのN-グリコシル化を防ぐために（10μg/ ml）をトランスフェクション時の細胞培養培地に含まれています。
3. 6ウェルプレートの各ウェル内のT細胞は、1μgのは、SNAP-25プラスミドとPBI-Gを反転し、0.5μgとのsyntaxin1プラスミド又は0.05μgとsyntaxin4プラスミド裏返し裏返しで同時トランスフェクトされています。
4. トランスフェクション後24時間は、V-細胞は、酵素を含まない細胞解離バッファ（Invitrogen）を用いて培養皿から切り離されます。剥離した細胞は、血球計を用いて計数し、DMEM、10％FBS、6.7μg/ mlのツニカマイシンおよび0.67 mMのDTTを補充HEPES緩衝に再懸濁する。
5. 4.8×10 ⁵ V、再懸濁した細胞はすでによくT細胞を含むそれぞれに追加されます。
6. 6,12または24時間後にラット37℃、5％CO ₂中に、β-ガラクトシダーゼの発現は、製造元の指示（Promega社）によるとレポーター溶解緩衝液にβ-ガラクトシダーゼ酵素アッセイ系を用いて測定される。簡単に言えば、細胞をPBSで2回洗浄され、その後、レポーター溶解緩衝液に溶解した。細胞溶解物をアッセイ2×等量のバッファーと混合される。ブランクコントロールとして、レポーター溶解緩衝液をアッセイ2×緩衝液と混合されています。
7. 90分後、比色反応を1M炭酸ナトリウムを添加することにより停止されています。
8. 420 nmの吸光度を100から40日立分光光度計を用いて測定される。

結果

定量的な細胞融合アッセイを開発するために、我々はTREにTTAの結合により強力な転写活性化を活用しています。 TTAの非存在下では、TRE-LacZ遺伝子における LacZ遺伝子の転写は、沈黙している。 TTAが存在する場合、それがTREに結合し、LacZの転写を活性化する。 図1は、酵素の細胞融合アッセイのフローチャートを示す。 TTAは、細胞表面での急行のv-SNAREタンパク...

ディスカッション

元の細胞融合アッセイ^6は蛍光顕微鏡法による、SNARE媒介細胞融合イベントを決定します。ここでは、β-ガラクトシダーゼおよび分光測定の活性発現によりSNARE媒介細胞融合事象を定量化する革新的なアッセイを説明します。このアッセイを使用して、我々は日常的に15を分析 - 20 V-及びt-SNARE一回の実験での組み合わせ。細胞表面でのSNARE発現を測定するためにフローサイトメトリーを?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬や機器の名称	会社	カタログ番号
DMEM	インビトロジェン	12800-017
COS-7細胞	ATCC	CRL-1651
ツニカマイシン	シグマアルドリッチ	T7765-5mgの
PTETオフ	クロンテック	K1620-
pBI系G	クロンテック	6150から1
リポフェクタミン	インビトロジェン	18324-012
無酵素細胞解離ソリューション	インビトロジェン	13151-014
ウサギ抗Tetリプレッサーポリクローナル抗体	ミリポア	AB3541
FITC結合ロバ抗マウスIgG（H + L）	JACksonのイムノ	715-095-150
レーザースキャニング共焦点顕微鏡	オリンポス	FV1000
FACSCaliburフローサイトメータ	BD Biosciences社
レポーター溶解緩衝液を有するβ-ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステム	プロメガ	E2000
モデル100から40、UV-VIS分光光度計	日立	C740843