JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Özet

SNARE (ler oluble N-etilmaleimid duyarlı faktör ttachment proteini yeniden reseptör) veziküller (v-SNARE) ve hedef membranlarda protein etkileşimleri (t-SNARE) intrasellüler vezikül füzyon 1-4 katalize. Sulandırma deneyleri SNARE-aracılı membran füzyon 5 mekanizması ve düzenleme kesme için gereklidir. Bir hücre füzyon deneyi 6,7 olarak, SNARE proteinler hücre yüzeyinde ektopik olarak ifade edilmiştir. Bu SNARE hücre zarının kaynaştırmak için yeterli olduğunu gösteren, SNARE proteinler tahrik hücre-hücre füzyonu "döndürülmüş". Hücre füzyon deneyi mikroskopik analiz dayandığından çok v-ve t-SNARE etkileşimleri kantitatif analiz için kullanılan zaman, daha az verimlidir.

Burada β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla, yeni bir tahlil 8 tarif. Ikitetrasiklin kontrollü Transaktivatörü (TTA) ve tetrasiklin yanıt elementinin kontrolü (TRE-lacZ) altında lacZ genini kodlayan bir haberci plazmid: Tet-Off gen ifade sistemi 9 bileşenlerinin bir ölçme sistemi olarak kullanılmaktadır. Ekspres hücre yüzeyinde t-SNARE çevrilen protein COS-7 hücrelerinin (T-hücreleri) içine hücre yüzeyinde v-SNARE proteinleri (v-hücreleri) ile transfekte TRE-lacZ çevrilen COS-7 hücreleri içine transfekte Bu TTA . TRE, lacZ transkripsiyonel aktivasyonu ve β-galaktosidaz ekspresyonu için TTA'nın bağlayıcı olarak V-ve T-hücrelerinin sonuç SNARE-bağımlı füzyon. Β-galaktosidaz aktivitesi 420 nm'de absorbans ile bir kolorimetrik yöntemle ölçülür.

Vezikül ilişkili membran proteinleri (vampirler) Çeşitli post-Golgi veziküler bölümlerinde 10-15 ikamet v-SNARE vardır. Aynı seviyede vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8 ile ifade, onların membran füzyonu karşılaştırmakenzimatik hücre füzyon deneyi kullanılarak faaliyetleri. Spektrometrik ölçüm dayanarak, bu testte SNARE-aracılı membran füzyon analiz ve yüksek verimlilik çalışmaları için nicel bir yaklaşım sunuyor.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

  1. COS-7 hücreleri, 4.5 g / l glikoz ve% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde kültürlenmiştir.
  2. Plazmid transfeksiyon üreticinin talimatlarına (Invitrogen) göre lipofektamin ile yapılır.

2. Hücre Yüzey SNARE İfade Floresan Mikroskobik Analizi

  1. Transfeksiyon önceki gün, 3 × 10 4 COS-7 hücreleri 24-kuyucuğu bulunan steril 12-mm cam lamelleri (Fisher Scientific) üzerine numaralı seribaşı.
  2. TTA kodlayan plazmid her iyi, 0.25 mcg v-hücreleri için (pTet-Off, Clontech) ekspres vamps çevrilen plazmid 0.25 mikrogram ile transfekte edilir.
  3. Her bir kuyudaki T hücreleri için, plazmid kodlama TRE-lacZ (PBI-G, Clontech) 0.25 ug 0.25 ug ekspres SNAP-25 ve syntaxins 1 veya 4 çevrilen plazmid her biri ile transfekte edilir.
  4. T sonra 24 saatransfection hücreler yine PBS içinde% 4 paraformaldehid + + 10 dakika boyunca (PBS 0.1 g / l CaCl2, 0.1 g / l MgCI2 ile desteklenmiş), ve sonra PBS içinde% 10 FBS içinde bloke + + 30 dakika süreyle sabitlenir.
  5. Hücreler, anti-myc monoklonal antikor 9E10 (neat hibridoma kültür yüzey maddesi) ile 1.5 saat için inkübe edilir.
  6. Ile dört yıkamadan sonra PBS + + hücreleri 1:500 dilüsyon FITC-konjuge sekonder antikor (Jackson Immunoresearch Laboratories) ile 1 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı.
  7. Ile dört yıkamadan sonra PBS + + etiketli hücreler antifade Gold reaktifi (Invitrogen) uzatmak da monte edilmiştir.
  8. Konfokal görüntüler Olympus lazer tarama konfokal mikroskop üzerinde toplanır. Görüntüler Adobe Photoshop yazılımı ile işlenir.

3. Hücre Yüzey SNARE İfade FACS Analizi

  1. Transfeksiyondan bir gün önce, 2 x 10 5 COS-7 hücreleri 6-plakaların her kuyuya tohumlanmıştır.
  2. Tra sonra 24 saatile nsfection SNARE, pTet-Off ve PBI-G plazmidler döndürülmüş, hücreler PBS içinde% 1 paraformaldehid + + ile 15 dakika daha sabit, ve sonra PBS içinde% 10 FBS içinde + + 15 dakika için bloke edilmiştir.
  3. Hücreler, 60 dakika boyunca, anti-myc monoklonal 9E10 antikoru ile inkübe edilir.
  4. Üç yıkamadan sonra PBS + +, hücreler 45 dakika süreyle FITC-konjuge sekonder antikor (1:200 dilüsyon) ile etiketlenir.
  5. PBS ile üç yıkar + +, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile plakalar kazınmış sonra.
  6. 15.000 hücreler FACSCalibur akış sitometresinin (BD Biosciences) kullanılarak analiz edilmektedir. Her bir numune grubunun ortalama floresan yoğunluğu CellQuest Pro yazılımı kullanılarak elde edilir.

4. Enzimatik Hücre Füzyon Deneyi

  1. Transfeksiyondan bir gün önce, 1.2 x 10 6 COS-7 hücrelerinin her biri 100 mm doku kültürü çanağı içinde ekildi ve 2 x 10 5 COS-7 hücreleri 6-plakaların her kuyuya tohumlanmıştır.
  2. 5, ug Flipp her biri - v-hücreleri, 0.5plazmid ed VAMP her 100-mm kültür çanak hücrelerine pTet-Off 5 mikrogram ile transfekte edilir. Kontrol hücreleri boş vektör pcDNA3.1 (+) ve pTet-Off ile transfekte edilmiştir. Vamps 1, 4, 5, 7 ve 8, tunicamycin N-glikolizasyon önlemek için, (10 ug / ml) transfeksiyon esnasında hücre kültürü aracı maddesi içinde yer almaktadır.
  3. 6-kuyucuğu her iyi t-hücreleri için, 1 mg SNAP-25 plazmid saygısız ve PBI-G 0.5 mikrogram ile transfekte edilir plazmid syntaxin4 saygısız plazmid syntaxin1 veya 0.05 mikrogram çevirdi.
  4. Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreler v-enzim içermeyen hücre Ayrılma Tamponu (Invitrogen) ile kültür kaplarından ayrılır. Kaldırılan hücreler bir hemasitometre ile sayılır ve resüspande edilirler, HEPES-tamponlu DMEM% 10 FBS, 6.7 ug / ml ve 0.67 tunicamycin mM DTT ile desteklenmiştir.
  5. 4.8 x tekrar süspanse 10 5 v-hücrelerinin her biri de zaten t-hücreleri içeren eklenir.
  6. 6, 12 veya 24 saat sonra, sıçan 37 ° C'de% 5 CO2 içinde , β-galaktosidaz ifade üreticinin talimatlarına (Promega) 'ye göre Reporter Lysis Buffer ile β-galaktosidaz Enzim Assay System kullanılarak ölçülür. Kısaca, hücreler PBS ile iki kez yıkanır ve daha sonra Reporter lizis tamponu içinde lize. Hücre lizatları 2 x Tahlil Tamponu içinde eşit hacmi ile karıştırılır. Boş bir kontrol olarak Muhabir Lizis Tampon Testi 2 × Tampon ile karıştırılır.
  7. 90 dakika sonra, reaksiyon kolorimetrik 1 M sodyum karbonat eklenmesi ile durdurulur.
  8. 420 nm Absorbans bir HITACHI 100-40 spektrofotometresi kullanılarak ölçülür.

Sonuçlar

Niceliksel bir hücre füzyon deneyi geliştirmek için, biz TRE TTA bağlama ile güçlü transkripsiyonel aktivasyon yararlanmak. TTA yokluğunda, TRE-lacZ yılında lacZ geninin transkripsiyonu sessizdir. TTA mevcut olduğu zaman, TRE bağlanır ve lacZ geni transkripsiyonunu aktive eder. Şekil 1, bu enzimatik hücre füzyon tahlil oluşan bir akış şeması gösterilmektedir. TTA hücre yüzeyinde ifade v-SNARE proteinler, ve TRE-lacZ T-hücreleri içine transfe...

Tartışmalar

Orijinal hücre füzyon deneyi 6 floresans mikroskobu ile SNARE-aracılı hücre füzyon olayları belirler. Burada β-galaktosidaz ve spektrometrik ölçüm aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla yenilikçi bir tahlil açıklamaktadır. Bu testte kullanarak, rutin analiz 15 - 20 v ve t-SNARE tek bir deneyde kombinasyonları. Hücre yüzeyinde ifade SNARE ölçmek için akış sitometrisi kullanılarak, vamps ifade seviyeleri titre ve membran füzyon kapasiteleri (Şekiller 2...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Louisville ve CA135123 Üniversitesi (CH) için başlangıç ​​fonları tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif ve ekipman Adı Şirket Katalog numarası
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 hücreleri ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
PBI-G Clontech 6150-1
lipofektamin Invitrogen 18324-012
Enzim-ücretsiz cep disosiasyon çözümü Invitrogen 13151-014
Tavşan anti-TET Baskılayıcı poliklonal antikor Millipore AB3541
FITC-konjuge eşek anti-fare IgG (H + L) Jackson Immunoresearch 715-095-150
Lazer tarama konfokal mikroskop Olimpos FV1000
FACSCalibur flowsitometri BD Biosciences
Muhabir Lizis Buffer ile β-Galaktosidaz Enzim Assay Sistemi Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spektrofotometre Hitachi C740843

Referanslar

  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 68BiyokimyaH cre BiyolojisiSNAREmembran f zyonVAMPsyntaxinvezik l

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır