Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

Resumo

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Resumo

As interacções dos SNARE (s factor de N-etilmaleimida sensível oluble ttachment um re ceptor de proteína) de proteínas em vesículas (v-SNAREs) e sobre as membranas-alvo (t-SNAREs) catalisam fusão das vesículas intracelulares ^1-4. Os ensaios de reconstituição são essenciais para dissecar o mecanismo e regulação de SNARE mediada por fusão de membrana ^5. Num ensaio de células de fusão ^6,7, proteínas SNARE são expressos ectopicamente na superfície da célula. Estes "invertida" SNARE proteínas unidade de fusão célula-célula, demonstrando que SNAREs são suficientes para fundir as membranas celulares. Uma vez que o ensaio de fusão de células é baseada na análise microscópica, é menos eficaz quando utilizado para a análise múltipla v-e t-SNARE interacções quantitativamente.

Descrevemos aqui um novo ensaio que quantifica ⁸ SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase. Doiscomponentes do sistema de expressão do gene Tet-Off ⁹ são utilizados como um sistema de leitura: o transactivador tetraciclina controlada (tTA) e um plasmídeo repórter que codifica para o gene LacZ sob o controlo do elemento de resposta a tetraciclina (TRE-LacZ). Nós tTA em transfectar células COS-7 que expressam invertidas v-SNARE proteínas na superfície da célula (V-células) e transfectam TRE-LacZ em células COS-7 que expressam invertida t-SNARE proteínas na superfície celular (células T) . SNARE dependente da fusão dos v-e t-células resulta na ligação de tTA a TRE, a activação da transcrição do LacZ e da expressão de β-galactosidase. A actividade de β-galactosidase é quantificado utilizando um método colorimétrico por absorvância a 420 nm.

As proteínas de vesículas associadas a membranas (Vamps) são v-SNAREs que residem em várias pós-Golgi compartimentos vesiculares ^10-15. Ao expressar Vamps 1, 3, 4, 5, 7 e 8 no mesmo nível, compara-se a sua fusão de membranaactividades utilizando o ensaio enzimático de fusão celular. Com base em medições de espectrometria, este ensaio proporciona uma abordagem para a análise quantitativa SNARE mediada por fusão de membrana e de alto rendimento estudos.

Protocolo

1. Cultura de Células e Transfecção

1. Células COS-7 foram cultivadas em Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM), suplementado com 4,5 g / l de glucose e 10% de soro fetal bovino (FBS).
2. Transfecção de plasmídeo foi feito com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).

2. Análise microscópica de fluorescência de células de expressão de superfície SNARE

1. Um dia antes da transfecção, 3 × 10 ⁴ células COS-7 foram semeadas em lamelas estéreis de 12 milímetros de vidro (Fisher Scientific), contidos em placas de 24 poços.
2. Para v-células em cada cavidade, 0,25 ug do plasmídeo que codifica tTA (BRST-Off, CLONTECH) é co-transfectadas com 0,25 ng dos plasmídeos que expressam invertidas VAMPS.
3. Para t-células em cada cavidade, 0,25 ug do plasmídeo que codifica TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) é co-transfectadas com 0,25 ug de cada um dos plasmídeos que expressam invertidas SNAP-25 e syntaxins 1 ou 4.
4. 24 horas após transfection, as células são fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS + + (PBS suplementado com 0,1 g / l _de CaCl2 e 0,1 g / l de MgCl _2), durante 10 min e, em seguida, bloqueadas em FBS a 10% em PBS + +, durante 30 minutos.
5. As células são incubadas durante 1,5 horas com os anti-Myc 9E10 anticorpos monoclonais (sobrenadante da cultura de hibridoma pura).
6. Depois de quatro lavagens com PBS + +, as células são incubadas durante 1 hora com FITC-anticorpos secundários conjugados (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a uma diluição de 1:500.
7. Depois de quatro lavagens com PBS + +, as células marcadas são montados em Prolongar reagente Antifade Gold (Invitrogen).
8. Imagens confocal são coletados em um microscópio de varredura a laser confocal Olympus. As imagens são processadas com o software Adobe Photoshop.

3. Análise FACS de células de expressão de superfície SNARE

1. Um dia antes da transfecção, 2 × 10 ⁵ células COS-7 foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços.
2. 24 hr após transfection com o virado SNARE, BRST-Off e pBI-G plasmídeos, as células são fixadas com paraformaldeído a 1% em PBS + +, durante 15 minutos, e, em seguida, bloqueadas em FBS a 10% em PBS + +, durante 15 minutos.
3. As células são incubadas com o anti-Myc 9E10 anticorpos monoclonais durante 60 min.
4. Após três lavagens com PBS + +, as células são marcadas com FITC-conjugado de anticorpos secundários (diluição a 1:200) durante 45 min.
5. Após três lavagens com PBS + +, as células são raspadas das placas com um raspador de células.
6. 15.000 células são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). A intensidade média de fluorescência de cada amostra é obtido utilizando o software CellQuest Pro.

4. Ensaio de Fusão celular enzimática

1. Um dia antes da transfecção, 1,2 x 10 ⁶ células COS-7 foram semeadas em cada placa de cultura de tecidos de 100 mm e 2 x 10 ⁵ células COS-7 foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços.
2. Para v-células, 0,5 - 5 mg cada de Flipped VAMP plasmídeo é co-transf ectadas com 5 ug de BRST-Off para dentro das células em cada placa de cultura de 100 mm. As células de controlo são co-transfectadas com o vector vazio pcDNA3.1 (+) e BRST-Off. Para impedir que o N-glicosilação de gáspeas 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 ug / ml) é incluída no meio de cultura celular durante a transfecção.
3. Para t-células em cada poço das placas de 6 poços, 1 ug do virado SNAP-25 e plasmídeo pBI-G são co-transfectadas com 0,5 ug de plasmídeo ou invertida syntaxin1 0,05 ug de plasmídeo syntaxin4 invertida.
4. 24 horas após a transfecção, o V-células são separadas de pratos de cultura com a enzima livre de dissociação celular Buffer (Invitrogen). As células destacadas são contadas com um hemocitómetro e novamente suspensas em HEPES-tampão DMEM suplementado com FBS a 10%, 6,7 ug / ml de tunicamicina e 0,67 mM de DTT.
5. 4,8 x 10 ⁵ ressuspenso v-As células são adicionadas a cada poço já contendo as células-T.
6. Depois de 6, 12 ou 24 horas de ratos de 37 ° C em CO2 a _5% , a expressão de β-galactosidase é medida utilizando o β-Galactosidase Sistema de Ensaio Enzimático com Tampão de Lise Repórter de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Resumidamente, as células são lavadas duas vezes com PBS, e depois foram lisadas em tampão de lise repórter. Os lisados ​​de células são misturadas com um volume igual de Tampão de Ensaio x 2. Como um controlo em branco, o Tampão de Lise Repórter é misturado com o tampão de Ensaio 2 ×.
7. Após 90 min, a reacção colorimétrica é parada pela adição de carbonato de sódio 1 M.
8. Absorvância a 420 nm é medida utilizando um espectrofotómetro de HITACHI 100-40.

Resultados

Para desenvolver um ensaio de fusão celular quantitativo, tiramos vantagem da activação transcricional forte pela ligação de tTA a TRE. Na ausência de tTA, a transcrição do gene LacZ em TRE-LacZ é silenciosa. Quando tTA estiver presente, liga-se ao TRE e activa a transcrição de LacZ. Figura 1 mostra um fluxograma do ensaio enzimático das células de fusão. tTA é transfectado em células que v-v-SNARE expressa proteínas na superfície celular, e TRE-LacZ...

Discussão

O ensaio de fusão de células original, ⁶ determina SNARE mediadas por eventos de fusão de células por microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui um ensaio que quantifica inovador SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase e medição espectrométrica. Utilizando este ensaio, que rotineiramente analisar 15-20 v-e t-SNARE combinações em uma única experiência. Utilizando citometria de fluxo para medir a expressão SNARE na superfície da célula, é ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente e equipamento	Companhia	Número de catálogo
DMEM	Invitrogen	12800-017
Células COS-7	ATCC	CRL-1651
tunicamicina	Sigma-Aldrich	T7765-5mg
BRST-Off	Clontech	K1620-A
pBI-G	Clontech	6150-1
lipofectamina	Invitrogen	18324-012
Enzima livre de célula de solução de dissociação	Invitrogen	13151-014
Coelho anti-TET anticorpo policlonal Repressor	Millipore	AB3541
FITC-conjugado de burro anti-IgG de ratinho (H + L)	JacImmunoResearch KSON	715-095-150
Microscópio de varredura a laser confocal	Olimpo	FV1000
FACSCalibur citômetro de fluxo	BD Biosciences
β-Galactosidase Sistema de Ensaio Enzima com Tampão de Lise Repórter	Promega	E2000
Modelo 100-40 espectrofotómetro de UV-VIS	Hitachi	C740843