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Method Article
枸橼酸rodentium感染提供了一个有价值的模型来研究肠道细菌感染以及宿主的免疫反应和结肠炎的小鼠。该协议概述了屏障的完整性测量,病原体负荷和病理损害,从而为深入鉴定病原体和宿主小鼠的感染性肠炎的贡献。
该协议列出的步骤需要产生一个强大的感染性疾病和肠炎的模型,以及用来描述枸橼酸rodentium感染的小鼠的方法。C. rodentium是一种革兰氏染色阴性,小鼠特异性细菌性病原体,临床上重要的人类病原体肠致病性大肠杆菌是密切相关的大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌大肠杆菌 。一旦感染C. rodentium,免疫小鼠患上温和和短暂的体重减轻和腹泻。组织学观察,肠隐窝伸长率,免疫细胞浸润,杯状细胞耗竭。实现间隙感染后3〜4周。肠上皮屏障的完整性,细菌量,以及组织损伤,感染后的不同时间点的测量,让易受感染的小鼠品系的特征。
致病机制s的细菌病原体定植于肠道他们的主机,以及具体的抵御这种感染的宿主反应,却知之甚少。因此,C. rodentium作为一个有价值的工具,以帮助我们了解这些过程模型肠道细菌感染。肠道细菌也被连接到的炎症性肠病(IBDs)。据推测,在肠黏膜免疫系统的异常暴露的肠道细菌基因易感个体适应不良的慢性炎症反应的IBD患者中发展。因此,感染性结肠炎模型的研究提供了重要C.确定潜在的致病性肠道细菌的宿主反应的潜力。 rodentium诱导的结肠炎就是这样一个难得的模式,让肠道细菌的宿主反应的分析,我们进一步了解鸡传染性法氏囊病发病的潜在机制;新的预防和治疗方法的发展至关重要。
肠道细菌病原体感染引发胃肠道(GI)的炎症,以及肠道病理学与病理生理学,包括腹泻和肠上皮屏障功能障碍。细菌病原体的殖民他们的主机,以及具体的抵御这种感染的宿主反应,胃肠道的致病机制了解甚少,但最近的进步已经开始在肠道细菌感染的造型,以帮助我们了解这些过程。肠道细菌也被连接到的炎症性肠病(IBDs)。 IBDs克罗恩病(CD)和UC复杂疾病的病因不明的慢性肠道炎症和组织损伤,其特征。许多模型小鼠肠道炎症的存在,从在遗传修饰的菌株,如IL-10 - / - 小鼠的自发炎症的化合物,如葡聚糖硫酸钠(DSS)和d,化学挑战initrobenzene磺酸(DNBS)1。据推测,适应不良的慢性炎症反应在IBD患者在遗传易感个体发展后肠黏膜免疫系统的异常暴露的肠道细菌,因此感染性结肠炎模型的研究也提供了显着的潜力,确定潜在的致病主机肠道细菌的反应。 枸橼酸杆菌rodentium诱导的结肠炎是罕见的模式已感染性结肠炎,以及其特征在于1,3之一,允许对分析的宿主反应,以肠溶性的细菌和潜在的IBD发病机制的进一步理解,一个重要的步骤在开发新的预防和治疗方法。
C. rodentium是革兰氏阴性安装和谦虚(A / E),小鼠的特异性细菌性病原体是密切相关的人体重要病原体肠致病性大肠杆菌大肠杆菌 (EPEC),肠出血性大肠杆菌大肠杆菌 (EHEC)3-8。的家庭的A / E病原体密切附加到根尖盲肠和结肠上皮细胞的宿主细胞的膜,形成一种非侵入性的台座状结构的宿主细胞。口腔挑战C. rodentium 10 8 -10 9生物体产生一个强大的感染性结肠炎模型,其特征在于由结肠的隐窝,单核的免疫细胞浸润和杯状细胞耗竭3,4增生或伸长。初始站点的殖民统治,几个小时后,面临的挑战,是在盲肠修补程序,然后发展到远端结肠感染后2〜3天,3。在免疫功能正常的小鼠品系中,间隙实现的病原体感染后3〜4周1,3,4。然而,许多转基因的菌株, 即基因缺失或基因敲除小鼠( - / - ),已被发现显示增加sed的感染导致夸张的损坏和/或慢性感染和炎症9-14的易感性。这在这些基因敲除株的感染性结肠炎模型,许多人缺乏与生俱来的信号蛋白,一直是不可或缺的分辨率的肠道感染和炎症的组成部分露出几个宿主蛋白。
1。 枸橼酸rodentium接种物的制备和小鼠灌胃
注:
2。测量结肠上皮屏障通透性C. rodentium感染的小鼠
注:
3。 C.组织中的细菌负荷测量rodentium感染的小鼠
4。组织学评估和感染肠组织免疫荧光染色
注:
在标准的感染实验,小鼠灌胃100μL过夜C.感染者约2.5×10 8 CFU通过rodentium文化。 与 C的C57BL / 6小鼠的感染rodentium结果,在温和和短暂的体重减轻和腹泻。虽然很少发生C57BL / 6小鼠,动物可能生病和需要euthanization。因此,鼠标应该减肥的程度和症状的困扰,如piloerect毛皮和驼背姿势进行监控,以确定不同菌株在何种程度上受到感染。
结果呈现?...
枸橼酸rodentium感染传染病的小鼠结肠炎的研究提供了一个有价值的模型。这种独特的模式允许两个宿主反应,以及细菌的致病特性的表征。这种模式的成功使用该协议的细节中列出的步骤。
有几个关键的步骤,在此协议时,请记住诱导结肠炎和分析反应。首先,准备一个新鲜的过夜C. rodentium在LB肉汤接种感染小鼠的成功。由于需要的剂量为10 8 -10 9
作者宣称,他们没有竞争的金融利益。
这项工作是支持的补助金BAV的克罗恩病和结肠炎基金会和加拿大卫生研究院(CIHR)加拿大(CCFC)。 GB CIHR研究生奖学金的资助。 BAV是的儿童肠和肝脏疾病(儿童)基金会主席儿科IBD的研究和加拿大研究主席在儿科胃肠病学。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
的试剂/材料名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
卢里亚肉汤 | ABM | G247 | 添加LB粉25克至1L水。高压灭菌后方可使用。 |
广场底板与电网 | 费舍尔 | 08-757-11A | |
猎鹰文化管 | 萨尔斯塔特 | 62.515.006 | |
灯泡放倒灌胃针 | 精细科学工具 | 18060-20 | |
1ml注射器 | BD Biosciences公司 | 309659 | |
4 kDa的FITC-葡聚糖 | 西格玛 | FD-4 | |
柠檬酸 | 西格玛 | C7129 | |
柠檬酸钠 | 费舍尔 | S279-500 | |
葡萄糖 | 费舍尔 | D16.1 | |
柠檬酸盐葡萄糖 | 的20mM ctiric酸,110 mM柠檬酸钠,5mM的葡萄糖 | ||
黑色96 - 孔板 | 费舍尔 | 07-200-762 | |
金属珠(5毫米) | Qiagen公司 | 69989 | |
10%的福尔马林 | 费舍尔 | 5F93-4 | |
5毫升小瓶 | DiaMed | STK3205 | |
苏木 | 费舍尔 | H345-23 | |
曙红 | 费舍尔 | E511-100 | |
二甲苯 | 费舍尔 | HC700-1GAL | |
吐温20 | 西格玛 | P5927 | |
科普林氏染色缸 | VWR | 47751-792 | |
柠檬酸钠缓冲液 | 10mM柠檬酸钠,0.05%吐温20,pH 6.0的 | ||
巴氏笔 | CEDARLANE | Mu22 | |
山羊血清 | 西格玛 | G902-3 | |
牛血清白蛋白(BSA) | 费舍尔 | BP1600-100 | |
的Triton X-100的 | 西格玛 | T8532 | |
叠氮化钠 | 西格玛 | SZ002 | |
封闭缓冲液 | 2%山羊血清,1%BSA,0.1%Triton X-100,0.05%吐温20,0.05%的氢氧化钠叠氮钠,0.01 M PBS,pH值7.2,混合储存于4°C。 | ||
抗体稀释液 | 0.1%Triton X-100,0.1%BSA,0.05%叠氮钠,0.04%EDTA | ||
阻断缓冲液和抗体稀释液TIR | 与上述相同的配方,但不添加的洗涤剂(TRITON X-100和吐温20) | ||
延长Gold抗淬灭试剂与DAPI | Invitrogen公司 | P-36931 | |
盖玻片 | 费舍尔 | 12.54SE | |
台式孵化振动筛 | Barnstead实验室线 | 最大Q4000 | |
荧光计 | Perkin Elmer公司 | Victor2D | |
冷冻离心机 | Beckman Coulter公司 | 微型离心22R | |
汽船 | Black&Decker公司 | ||
荧光显微镜 | 蔡司 | Axio上Image.Z1 |
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