<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

요약

Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

초록

이 프로토콜은 전염성 질환과 대장염의 강력한 모델을 생산하는 데 필요한 단계뿐만 아니라, 마우스에 Citrobacter rodentium 감염을 특징하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. C.는 rodentium는 밀접하게 임상 적으로 중요한 인간 병원체 enteropathogenic E. 관련되어 g 제외, 손쥐 특정 세균 병원균입니다 대장균 및 enterohemorrhagic E. 대장균. C.로 감염시 rodentium, 면역 적격 마우스는 겸손과 과도 체중 감소, 설사로 고통 받고 있습니다. Histologically, 장 토굴 신장, 면역 세포 침투 및 고 블렛 셀 고갈을 준수하고 있습니다. 감염의 등급이 3-4주 후 이루어집니다. 감염 후 다른 시간 지점에서 장 상피 장벽 무결성, 박테리아 부하 및 조직 학적 손상의 측정은 감염에 민감 마우스 종자의 특성을 수 있습니다.

독성 메커니즘s이 (가) 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 창자를 이식하는이 제대로 이해하고 있습니다. 따라서 C. 장용 세균 감염의 rodentium 모델은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해에 도움이 할 수있는 유용한 도구 역할을합니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. 그것은 IBD 환자에서 볼 수 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 후 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다. 따라서, 전염성 대장염의 모델의 연구는 장용 박테리아에 잠재적으로 병원성 호스트 응답을 정의하기위한 중요한 가능성을 제공합니다. C.는 rodentium 유도 대장염은 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전, 장용 박테리아에 대한 호스트 응답의 분석을 허용 하나의 희귀 한 모델이다;소설 예방 및 치료 치료의 개발에 필수적.

서문

장용 세균 병원균에 의해 감염이 위장 (GI) 염증뿐만 아니라, 설사 및 장 상피 장벽 기능 장애 등의 장 병리학 및 pathophysiology을 트리거합니다. 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 GI 기관을 식민지화하는이 독성 메커니즘이 잘못 이해되어 장용 세균 감염의 모델링에 그러나 최근 발전은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해를 돕기 위해 시작했습니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. IBDs Crohn의 질병 (CD)와 UC 만성 장 염증 및 조직 손상을 특징으로 알 수없는 병인의 복잡한 질병입니다. 이러한 dextran 나트륨 황산 (DSS)와 D와 같은 화합물과 화학 도전에, 마우스 - / - 장 염증의 많은 마우스 모델은 IL10와 같은 유전자 변형 종자에 자연스럽게 염증의 존재initrobenzene 설 폰산 (DNBS) ^1. 그것은 IBD 환자에 존재 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 ^2, 그러므로 전염성 대장염의 모델의 연구는 잠재적으로 병원성 호스트를 정의하는 중요한 가능성을 제공에 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다 . 장용 박테리아에 대한 답변 Citrobacter rodentium 유도 대장염은 장의 박테리아와 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘의 추가 이해에 대한 호스트 응답의 분석을 위해 수 있도록 잘 ^1,3를 특징으로 한 감염성 대장염의 희귀 모델 중 하나이며, 필수 단계 소설 예방 및 치료 치료를 개발 인치

C. rodentium는 밀접하게 중요한 인간과 관련되어 (A / E) g 부착 부정적인 및 나온다, 손쥐 특정 세균 병원균입니다병원체 enteropathogenic E. 대장균 (EPEC) 및 enterohaemorrhagic E. 대장균 (EHEC) ^3-8. A / E의 병원균의 가족은 깊은 숙주 세포에 비 침습적 받침대와 같은 구조를 형성 cecal과 colonic 상피의 꼭대기 숙주 세포 막에 첨부합니다. C.이있는 구두 도전 10 ⁸ -10 ⁹ 생물의 rodentium은 crypts, mononuclear 면역 세포 침투와 고 블렛 셀 고갈 ^3,4의 colonic 증식이나 신장을 특징으로 전염성 대장염의 강력한 모델을 생산하고 있습니다. 식민지의 초기 사이트는 몇 시간 도전 한 후, cecal 패치에 2-3일 감염 ³ 후 말초 콜론으로 진행을합니다. 면역 적격 마우스 변종에서 병원균의 등급이 3-4주 감염 ^1,3,4 후에 이루어집니다. 그러나 많은 유전자 변형 종자는 즉, 유전자 결함 또는 녹아웃 (- / -) 생쥐는 increa를 표시 할 수 발견되었습니다과장 손상 및 / 또는 만성 감염과 염증 ^9-14의 결과로 감염에 느끼기 쉬운 상태를 SED. 이 녹아웃의 변종이 전염성 대장염 모델의 사용, 본래 신호 단백질이 부족한 많은 사람들이, 장 감염 및 염증의 해상도에 필수적인 여러 호스트 단백질을 드러내 indispensible있다.

프로토콜

1. Citrobacter rodentium Inoculum와 마우스의 사정 Gavage의 작성

1. 준비와 Luria Bertani 국물 (LB)를 압력솥.
2. 가능한 C.를 얻을 멸균 inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 한천 플레이트로 냉동 글리세롤 주식과 승리의 rodentium. 37 ° C 하룻밤에 품다. inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 플레이트의 식민지로 매 문화 관 멸균 LB의 국물 3 ML의 예방. inoculum의 준비는 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다.
3. C.를 품다 rodentium 문화 aerobically 37 번 ° C 200 rpm으로 benchtop 부화 흔드는에서 하룻밤. 주사 LB의 국물은 밤새 문화 흐린 후 나타납니다.
4. 전구를 사용 밤새 C. 100 μl 각 마우스를 gavage하기 위해 1 ML의 주사기에 부착 된 위 gavage 바늘을 팁 rodentium 문화. 단단히 목 다시 위에 느슨한 피부를 쥐었고하여 부드럽게 안녕하세요, 마우스를,엄지와 손가락. 머리를 고정하고 gavage 바늘의 삽입을 위해 식도를 바르게 색인 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당겨.
5. 수직 위치에 마우스를 유지하고 입의 측면을 따라와 혀 위에 gavage 바늘의 전구 팁을 지시. 부드럽게 입의 지붕을 따라 바늘을 통과하고 식도를 내려 향상. 이 절차를 수행하는 동안 느낌이 어떤 저항이있을 경우 gavage 바늘을 제거하고 다시 삽입합니다.
6. 천천히 세균 inoculum 100 μl를 삽입하고 부드럽게 gavage 바늘을 제거합니다. 그 케이지에 반환 한 후 마우스의 호흡 속도와 동작을 모니터링 할 수 있습니다.

참고 사항 :

• 2 단계와 3 단계에서 또한 국물 자체의 어떤 세균 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 밤새 배양 할 무균 LB의 국물 3 ML과 무균 기술을 사용하여 매 문화 튜브를 준비합니다. LB의 국물은 밤새 문화 이후에 명확 나타납니다.
• 을 부드럽게 박테리아의 동등한 복용량은 4 단계에서 각 마우스에 전달 될 수 있도록 gavage에 주사기를로드하기 전에 매 관 내에서 문화를 선동.
• 이 24 시간 이상 주사 한 경우 숙박 문화는 폐기해야합니다.
• 모든 C. 감염된 동물의 rodentium 감염 및 주택은 바이오 레벨 2 시설에서 수행되어야한다.

2. C.에 Colonic 상피 장벽 투과율 측정 rodentium에 감염된 마우스

1. 원하는 시점 이후의 감염에 장벽 무결성을 측정합니다.
2. 검정의 날, 4 kDa fluorescein의 isothiocyanate (FITC) - dextran 150 μl 각 마우스를 gavage하고 표준 곡선을 준비하는 80 MG ML ^-1의 농도로 생리 (PBS)를 버퍼 인산에 용해 충분한 준비합니다.
3. FITC-dextran의 150 μl와 안녕하세요, 마우스와 gavage. 이 시간에 우리를에서 음식을 철회 할 수 있습니다.
4. 후 마우스에게 4 시간을 마취gavaging 및 심장 구멍을 통해 가능한 한 많은 양의 피 (~ 450 μl)로 수집합니다. 응고를 억제하는 microcentrifuge 관 3퍼센트 산 구연산의 덱스 트로 오스의 최종 농도에 혈액을 추가합니다. 쥐를 안락사시켜야하고 박테리아 카운트 (단계 3.1-3.5)에 대한 PBS에서 colonic 조직을 수집하고 조직 고정 용 포르말린, 그리고 궁극적으로 immunofluorescence 얼룩 10 % (단계 4.1-4.8)에 있습니다.
5. 4 ° C.에서 원심 분리기에서 12 분 1,000 XG에서 혈액 샘플을 스핀 혈청을 수집하여 PBS의 10분의 1과 1 / 100 희석. 복제에 96 잘 판에이 두 dilutions 각 샘플 100 μl를 추가합니다.
6. 표준 곡선을 준비하려면 원래의 80 MG ML ^-1 FITC-dextran은 다음과 농도에 PBS에서 쥐를 gavage하는 데 사용 희석 : 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 μg / ML . 세중의에 96 잘 판에 각 농도 100 μl를 추가합니다.
7. 여기 WAV에서 fluorometer를 사용하여 각 샘플의 형광을 수량화485 나노 미터와 535 nm의 방출 파장의 elength.
8. 표준 곡선을 음모하여 원시 데이터를 분석합니다. 입력 각 샘플에 FITC-dextran의 농도를 결정하기 위해 표준 곡선에 의해 생성되는 라인의 방정식에 각 샘플에 대한 원시 데이터입니다.

참고 사항 :

• 4 단계 이후로, 얼음에 혈액 샘플을 유지하고 빛에 노출을 최소화합니다.
• 심각한 조직 손상이이 시점 이후에 발생로 시점에서, 또는 그 이전에 상피 장벽 무결성을 측정 할 경우 7 일 이후 감염 최적입니다. 심각한 피해가 발생하기 전에 장벽 무결성을 측정하면 C. 동안 투자율의 최대 차이를 확인할 수 있습니다 마우스 변종 사이의 rodentium 감염.
• 감염되지 않은 컨트롤 마우스도 상피 장벽의 무결성에 대한 테스트되어 있는지 확인합니다.

3. C.의 조직에서 세균 하중 측정 rodentium에 감염된 마우스

1. 한 ML 멸균 PBS를 추가ND은 원형에 구슬 autoclaved 금속은 무균 기술을 사용하여 두 ML의 원심 분리기 튜브를 버린. 각 동물로부터 수집 된 개인 조직은 별도의 PBS 튜브에 배치됩니다. 조직의 추가하기 전에 튜브를 무게.
2. 마우스에서이게 맹장과 결장을 제거합니다. 콜론에서이게 맹장을 분리하고 집게를 사용하여 luminal 내용을 밀어. PBS 관에 내용을 추가합니다. 10% 포르말린 고정의 말초 콜론과이게 맹장에서 0.5 cm 섹션을 분리 한 후 길이 방향으로 나머지 콜론과이게 맹장을 잘라 튜브에 조직을 배치하기 전에 멸균 PBS로 씻어.
3. 조직과 PBS 튜브를 무게 그리고 30 Hz에서 6 분을 위해 구슬 때리는를 사용하여 샘​​플을 균질화.
4. 무균 기술 사용 96 잘 플레이트에 잘 당 180 μl 멸균 PBS를 추가합니다. 각 행의 첫 번째도 각 균질 샘플의 20 μl를 추가합니다. 잘 섞어서 순차적으로 (먼저 10 ^-1에서 dilutions를 얻기 위해 잘 각 이전에서 20 μl를 추가 희석10 ^-6까지) 붙인다. 그리드와 사각형 바닥 LB 플레이트에 세중의 각 샘플에서 각 희석의 플레이트 10 μl. 37 박 품다 ° C.
5. 그리고 평균 식민지 성형 단위 (CFU), 3 카운트를 계산하고, 각 샘플이 계산 된에 희석를 기록합니다. 원래 1 ML 샘플의 20 μl이 사용 된 것처럼, 50으로 평균 CFU를 곱하며, 샘플 CFU / ML의 결과로 계산 된에 희석 요인에 의해. 마지막으로, CFU / g를 결정하는 조직 무게로 나눕니다.

4. 조직 학적 평가와 감염된 장 조직의 Immunofluorescence 착색

1. 단계 3.2에서와 같이 조직을 수집합니다. 포르말린 하룻밤에 저장 조직은 다음 70 % 에탄올로 씻는다. 파라핀에 조직을 추가하고 착색 5 μm 섹션을 잘라. 조직 학적 평가에 대한 hematoxylin & eosin으로 청바지와 immunofluorescence 얼룩을위한 다음 단계로 진행합니다.
2. 이전 착색에 조직을 deparaffinize하려면, 장소에 슬라이드65 10 분에 대한 ° C 물 목욕에 coplin의 착색 병 등을 넣어. 다음, 2 분마다 네 개의 세차에 대한 크실렌의 장소 슬라이드. 95 % 에탄올, 75 % 에탄올과 DH ₂ 0 : 슬라이드가 다음 하나 5 분 다음 각 세척에 이어 100 % 에탄올에 두 개의 5 분 세차와 rehydrated해야합니다. 이러한 세차는 유해한 증기에 노출을 피하기 위해 퓸 배출 후드에서 수행해야합니다.
3. 30 분의 증기선에 미리 예열 나트륨 구연산 버퍼 한 후 이곳의 coplin 병의 장소 슬라이드 한 다음 30 분에 앉아 보자. 이 과정은 단백질 잠재적 인 antigenic 사이트를 검색 포르말린 고정에 의해 형성된 간 링크를시킵니다.
4. 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 드라이 슬라이드와 조직에 지역화 착색의 시약을 유지, 소수성 장벽을 생성 할 수 PAP 펜과 조직 주변 마크 공간이 마련되어 있습니다.
5. immunostaining 수분 챔버에서 차단 버퍼로 실온에서 1 시간 (예 : α-염소 혈청)에 대한 블록 조직.
6. 꼼꼼한를 희석워 항체가 원하는 농도에 항체 희석 버퍼를 사용합니다. 버퍼를 차단 해제 넣어와 조직에 주요 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 4 2 시간에 ° C 야간이나 실내 온도에서에 품다.
7. 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 조직 및 배양에 항체 희석 버퍼에 희석 이차 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 5 분 세 번 DH ₂ O로 씻으십시오.
8. DAPI 골드 장착 중간을 연장하고 coverslip을 적용 추가 슬라이드를 탈수. 형광 현미경 슬라이드를 표시합니다.

참고 사항 :

• PBS azide는 4 단계 이후의 세척 매체의 박테리아 성장을 방지 할 수있는 대안으로 신선하게 조리 된 PBS로 대체 할 수 있습니다.

결과

표준 감염 실험이 진행되는 동안, 마우스는 100 μl 박 C.의 gavage을 통해 약 2.5 X 10 ⁸ CFU에 감염된 rodentium 문화. C.와 C57BL / 6 마우스의 감염 겸손과 과도 체중 감소, 설사에 rodentium 결과이다. C57BL / 6 마​​우스와 드문, 동물은 병이되고 euthanization가 필요할 수 있습니다 있지만. 따라서, 쥐가 다른 변종은 감염에 의해 영향을받습니다 할 수있는 범위를 결정하기 위해, 체중 ?...

토론

Citrobacter rodentium 감염은 전염성 질병과 쥐 대장염 모두의 연구 귀중한 모델을 제공합니다. 이 독특한 모델은 두 호스트 응답뿐만 아니라 세균의 병원성 속성의 특성을 허용합니다. 단계는이 프로토콜 세부 사항에이 모델의 성공적인 사용을 설명했다.

대장염을 유도하고 응답을 분석 할 때 염두에 두어야 할이 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 신선한 밤...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Luria 국물	ABM	G247	물 1L에 LB 가루 25g을 추가합니다. 사용하기 전에 압력솥.
그리드와 광장 바닥 판	어부	08-757 - 11A
팔콘 문화 관	Sarstedt	62.515.006
전구는 위 gavage 바늘이 팁	정밀 과학 도구	18060-20
1 ML의 주사기	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC - dextran	시그마	FD-4
구연산	시그마	C7129
나트륨 시트르산	어부	S279-500
우선 당	어부	D16.1
산성 구연산 덱스 트로 오스			20 MM ctiric 산, 110 MM 나트륨 구연산, 5 MM 덱스 트로 오스
블랙 96 - 웰 플레이트	어부	07-200-762
금속 구슬 (5 ㎜)	Qiagen	69,989
포르말린 10%	어부	5F93-4
5 ML의 약병	DiaMed	STK3205
Hematoxylin	어부	H345-23
Eosin	어부	E511-100
크실렌	어부	HC700-1GAL
십대 초반 20	시그마	P5927
Coplin의 착색 병	VWR	47751-792
나트륨 시트르산 버퍼			10 MM 나트륨 구연산, 0.05 % 십대 초반 20 pH를 6.0
자궁 펜	Cedarlane	Mu22
염소 혈청	시그마	G902-3
소 혈청 알부민 (BSA)	어부	BP1600-100
트리톤 X-100	시그마	T8532
나트륨 azide	시그마	SZ002
버퍼를 차단			2 % 염소 혈청, 1 % BSA, 0.1 % 트라이 튼 X-100, 0.05 % 십대 초반 20 0.05 % 나트륨azide, 0.01 M PBS, pH를 7.2, 4에 혼합 및 저장 ° C.
항체 희석 버퍼			0.1 % 트라이 튼 X-100, 0.1 % BSA, 0.05 % 나트륨 azide, 0.04 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
티르에 대한 차단 버퍼 및 항체 희석 버퍼			위와 같이하지만, 세제의 추가 (트라이 튼 X-100과 십대 초반 20)없이 동일 요리법
DAPI와 골드 Antifade의 시약을 연장	Invitrogen	P-36931
Coverslips	어부	12.54SE
Benchtop 부화 흔드는	Barnstead 연구소 선	최대 Q4000
Fluorometer	Perkin 엘머	Victor2D
냉장 원심 분리기	Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날	Microfuge 22R
기선	블랙 & 데커
형광 현미경	Zeiss	Axio Image.Z1