La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

Resumen

Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

Resumen

Este protocolo describe los pasos necesarios para producir un modelo robusto de enfermedades infecciosas y colitis, así como los métodos usados ​​para caracterizar la infección por Citrobacter rodentium en ratones. C. rodentium es un gram negativo, murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con la importancia clínica humana enteropatógena patógenos E. coli y E. enterohemorrágica coli. Tras la infección con C. ratones inmunocompetentes rodentium, sufren de pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Histológicamente, el alargamiento de cripta intestinal, infiltración de células inmunes, y la depleción de células caliciformes se observó. Aclaramiento de la infección se logra después de 3 a 4 semanas. La medición de la integridad de la barrera epitelial intestinal, la carga bacteriana, y daño histológico en diferentes puntos temporales después de la infección, permiten la caracterización de cepas de ratón sensibles a la infección.

El mecanismo de virulencias por el cual las bacterias patógenas colonizan el tracto intestinal de los anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos. Por lo tanto el C. rodentium modelo de infección bacteriana entérica sirve como una herramienta valiosa para ayudar en la comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Se ha planteado la hipótesis de que las respuestas inflamatorias crónicas inadaptadas observados en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas. Por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa ofrece un potencial significativo para la definición de las respuestas potencialmente patógenas de acogida a bacterias entéricas. C. rodentium colitis inducida es un modelo poco común que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas, ampliar nuestro conocimiento de los posibles mecanismos de la patogénesis de la EII;esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.

Introducción

La infección por patógenos bacterianos entéricos desencadena gastrointestinal (GI) la inflamación, así como patología intestinal y la fisiopatología, incluyendo la diarrea y la disfunción intestinal barrera epitelial. Los mecanismos de virulencia de patógenos bacterianos que colonizan el tracto gastrointestinal de sus anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos, sin embargo, los avances recientes en la modelización de las infecciones bacterianas entéricas han comenzado a ayudar a nuestra comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Enfermedad de Crohn La EII (CD) y UC son enfermedades complejas de etiología desconocida, caracterizada por la inflamación crónica intestinal y daño tisular. Muchos modelos de ratón de inflamación intestinal existen, de la inflamación espontánea en cepas genéticamente modificados, tales como IL10 - / - ratones, a los desafíos químicas con compuestos, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) y dinitrobenzene sulfónico (DNBS) ^1. Se ha hipotetizado que las inadaptadas respuestas crónicas inflamatorias presentes en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas ^2, por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa también ofrece un potencial significativo para definir potencialmente patógena anfitrión . respuestas a bacterias entéricas Citrobacter rodentium colitis inducida es uno de los modelos raros de colitis infecciosa que ha sido bien caracterizado ^1,3, lo que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas y una mayor comprensión de los mecanismos posibles de la patogénesis de la EII; un paso esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.

C. rodentium es una bacteria gram negativa adhesión y borrado (A / E), murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con el ser humano importantepatógenos enteropatógena E. coli (EPEC) y E. enterohemorrágica coli (EHEC) ^3-8. La familia de patógenos A / E íntimamente adjuntar a la membrana de la célula huésped apical del epitelio cecal y colon, la formación de un no-invasivo pedestal-como la estructura de la célula huésped. Desafío oral con C. rodentium de 10 ⁸ -10 ⁹ organismos produce un robusto modelo de colitis infecciosa caracterizada por hiperplasia colónica o alargamiento de las criptas, la infiltración de células mononucleares inmune y el agotamiento de las células caliciformes ^3,4. El sitio inicial de colonización, unas pocas horas después de la exposición, se encuentra en el parche cecal, seguida por evolución en el colon distal 2 a 3 días después de la infección ^3. En cepas de ratones inmunocompetentes, el despacho del agente patógeno se logra 3 a 4 semanas después de la infección ^1,3,4. Sin embargo, muchas cepas genéticamente modificados, es decir, gen deficiente o knockout (- / -) ratones, se han encontrado para mostrar increased susceptibilidad a la infección que resulta en daño exagerada y / o infección crónica y la inflamación ^9-14. El uso de este modelo de colitis infecciosa en estas cepas knockout, muchos carecen de las proteínas de señalización innatas, ha sido indispensable en la revelación de varias proteínas de acogida integral a la resolución de la infección intestinal y la inflamación.

Protocolo

1. Preparación del inóculo y Citrobacter rodentium sonda oral de ratones

1. Preparar y esterilizar en autoclave caldo Luria Bertani (LB).
2. Obtener viable C. rodentium de una reserva de glicerol congelado y raya sobre la placa de LB agar con un asa de inoculación estéril o punta de pipeta. Incubar a 37 ° C durante la noche. Inocular 3 ml de caldo LB estéril en un tubo de cultivo Falcon con colonias de la placa de LB con un asa de inoculación o punta de la pipeta. Preparación del inóculo debe hacerse utilizando técnicas asépticas.
3. Incubar la C. cultura rodentium aeróbicamente a 37 ° C durante la noche en un agitador de incubación de sobremesa a 200 rpm. El caldo LB inoculados deben aparecer turbia después del cultivo durante la noche.
4. Use un bulbo con punta de aguja gástrico sonda unida a una jeringa de 1 ml a cada ratón por sonda con 100 l de la noche a la mañana C. rodentium cultura. Suavemente scruff el ratón, sujetando firmemente la piel suelta sobre su cuello y la espaldacon el pulgar y los dedos. Tire hacia atrás de la cabeza del animal con su dedo índice para inmovilizar la cabeza y estirar el esófago para la inserción de la aguja sonda.
5. Mantener el ratón en una posición vertical y dirigir la punta de la bombilla de la sonda de aguja a lo largo del lado de la boca y sobre la lengua. Suavemente pasar la aguja a lo largo del techo de la boca y hacerlo avanzar por el esófago. Si hay alguna resistencia que durante este procedimiento, retire la aguja sonda y vuelva a insertarlo.
6. Poco a poco se inyectan 100 l de inóculo bacteriano y retire suavemente la aguja sonda. Supervisar la tasa de respiración y comportamiento del ratón después de regresar a su jaula.

Notas:

• En los pasos 2 y 3, también preparar un tubo de cultivo Falcon usando técnicas asépticas con 3 ml de caldo LB estéril que se cultivaron durante la noche para garantizar que no hay contaminación bacteriana del propio caldo. El caldo de LB debe ser transparente después del cultivo durante la noche.
• Agitar suavemente el cultivo dentro del tubo Falcon antes de cargar jeringas para sonda de modo que una dosis igual de bacterias se entrega a cada ratón, en el paso 4.
• Cultivo de una noche se deben desechar si se ha inoculado durante más de 24 h.
• Todas C. infecciones rodentium y el alojamiento de los animales infectados deben llevarse a cabo en un nivel de bioseguridad 2 instalaciones.

2. Medición de la permeabilidad del colon barrera epitelial en C. rodentium ratones infectados

1. Medir integridad de la barrera en un punto de tiempo deseado después de la infección.
2. En el día del ensayo, preparar suficientemente 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano disuelto en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración de 80 ^-1 mg ml a cada ratón por sonda con 150 l y para preparar la curva estándar.
3. Scruff el ratón y la alimentación forzada con 150 l de FITC-dextrano. Retirar los alimentos de la jaula en este momento.
4. Anestesie ratones 4 horas despuésgavage y recoger la mayor cantidad de sangre posible (~ 450 l) a través de punción cardíaca. Añadir la sangre a una concentración final de ácido-citrato dextrosa 3% en un tubo de microcentrífuga para disuadir la coagulación. Eutanasia a los ratones y recoger tejidos de colon en PBS para recuentos bacterianos (pasos de 3,1 a 3,5) y en 10% de formalina durante la fijación del tejido y, finalmente, la tinción de inmunofluorescencia (pasos desde 4,1 hasta 4,8).
5. Girar las muestras de sangre a 1.000 xg durante 12 min en una centrífuga a 4 ° C. Se recoge el suero y se diluye a 1/10 y 1 100 / en PBS. Añadir 100 l de cada muestra en estos dos diluciones a una placa de 96 pocillos en repeticiones.
6. Para preparar la curva estándar, se diluye la original de 80 mg ml ^-1 FITC-dextrano usado por sonda a los ratones en PBS a las concentraciones siguientes: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, y 0 g / ml . Añadir 100 l de cada concentración a una placa de 96 pocillos por triplicado.
7. Cuantificar la fluorescencia de cada muestra usando un fluorómetro a una excitación wavelength de 485 nm y 535 nm de longitud de onda de emisión.
8. Analizar los datos sin procesar mediante el trazado de la curva estándar. Introducir los datos brutos para cada muestra en la ecuación de la línea generada por la curva estándar para determinar la concentración de FITC-dextrano en cada muestra.

Notas:

• A partir del paso 4 en adelante, mantener las muestras de sangre en el hielo y minimizar la exposición a la luz.
• Cuando se mide la integridad de la barrera epitelial de un punto en el tiempo, o antes de los 7 días después de la infección es óptima, como el daño tisular grave se produce después de este punto. Medición de integridad de la barrera antes de que ocurra daño grave le permite determinar las diferencias en la permeabilidad máxima durante C. rodentium infección entre las cepas de ratón.
• Asegúrese de que los ratones control no infectadas también se prueban para integridad de la barrera epitelial.

3. La medición de la carga bacteriana en tejidos de C. rodentium ratones infectados

1. Añadir 1 ml de PBS estéril unand un metal tratada en autoclave de vidrio hasta un fondo redondo de 2 ml tubo de centrífuga mediante una técnica aséptica. Tejidos individuales de cada animal se colocó en tubos separados de PBS. Pesar los tubos antes de la adición del tejido.
2. Retire el ciego y el colon desde el ratón. Separe el ciego del colon y eliminar el contenido luminal utilizando fórceps. Añadir el contenido de un tubo de PBS. Después de separar secciones de 0,5 cm en el colon distal y el ciego para 10% de fijación con formalina, cortar y abrir el colon y el ciego restante longitudinalmente y lavar con PBS estéril antes de colocar los tejidos en tubos.
3. Pesar los tubos de PBS con el tejido y, a continuación homogeneizar las muestras usando un batidor de cuentas durante 6 min a 30 Hz.
4. El uso de técnicas asépticas, añadir 180 l de PBS estéril por pocillo a una placa de 96 pocillos. Añadir 20 l de cada muestra homogeneizada para el primer pocillo en cada fila. Mezclar bien y diluir en serie, la adición de 20 l de cada pozo anterior para obtener diluciones de 10 ^-1 (primerll) de 10 ^-6. Placa de 10 l de cada dilución de cada muestra por triplicado en una placa de fondo cuadrada LB con una rejilla. Incubar durante una noche a 37 ° C.
5. Cuente unidades formadoras de colonias (UFC), entonces el promedio de los 3 cuentas y registrar la dilución en la que se contó cada muestra. Multiplicar promedio CFU por 50, como 20 l de la muestra original de 1 ml se utilizó, y por el factor de dilución en la que se contó la muestra resultante en CFU / ml. Por último, se divide por el peso del tejido para determinar CFU / g.

4. Evaluación histológica y tinción de inmunofluorescencia de tejidos infectados Colon

1. Recoge los tejidos como en el paso 3.2. Tienda de tejidos en formalina durante la noche, luego lavar con etanol al 70%. Insertar tejidos en parafina y se cortaron secciones de 5 micras para la tinción. Teñir con hematoxilina y eosina para la evaluación histológica y continúe con los pasos siguientes para la tinción de inmunofluorescencia.
2. Para Desparafinar tejidos antes de la tinción, se desliza en lugaruna cubeta de Coplin y poner en baño de agua 65 ° C durante 10 min. A continuación, colocar los portaobjetos en xileno durante cuatro lavados de 2 minutos cada uno. Diapositivas entonces debe ser rehidratado con dos lavados de 5 minutos en 100% de etanol, seguido de un lavado de 5 min en cada uno de los siguientes: 95% de etanol, 75% de etanol y dH ₂ 0. Estos lavados se debe hacer en una campana de humos para evitar la exposición a los vapores nocivos.
3. Colocar los portaobjetos en la jarra Coplin con pre-calentado tampón de citrato de sodio y entonces coloque en un vapor durante 30 min, a continuación, dejar reposar durante 30 min. Este proceso rompe la proteína enlaces cruzados formados por la fijación con formalina recuperación de sitios antigénicos potenciales.
4. Lavar con PBS azida durante 5 minutos, tres veces. Portaobjetos secos y de zona de marca alrededor del tejido con un bolígrafo PAP para crear una barrera hidrófoba, manteniendo los reactivos de tinción localizados en el tejido.
5. Bloque de tejido durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (por ejemplo, α-suero de cabra) en una cámara de humedad inmunotinción.
6. Diluir primanticuerpo ary a la concentración deseada usando tampón de dilución de anticuerpos. Retirar el amortiguador de bloqueo y añadir 50-100 l de anticuerpo primario a los tejidos. Incubar a 4 ° C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h.
7. Lavar con PBS azida durante 5 minutos, tres veces. Añadir 50-100 l de anticuerpo secundario diluido en tampón de dilución de anticuerpo a los tejidos y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. Lavar con dH ₂ O durante 5 min, tres veces.
8. Deshidratar diapositivas, añadir DAPI Prolongar medio Oro de montaje y colocar un cubreobjetos. Ver desliza debajo de un microscopio de fluorescencia.

Notas:

• PBS azida puede estar sustituido con PBS recién preparado como una alternativa para evitar el crecimiento bacteriano en el medio de lavado de la etapa 4 en adelante.

Resultados

Durante un experimento de infección estándar, los ratones se infectaron con aproximadamente 2,5 x 10 ⁸ UFC a través de una sonda de 100 l C durante la noche rodentium cultura. La infección de ratones C57BL / 6 con C. rodentium resultados en pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Aunque sucede rara con C57BL / 6 ratones, los animales pueden enfermarse y requerir la eutanasia. Por lo tanto, los ratones deben ser monitorizados para el grado de pérdida de peso y síntom...

Discusión

Citrobacter rodentium infección proporciona un modelo valioso para el estudio tanto de la enfermedad infecciosa y colitis en ratones. Este modelo único permite la caracterización de las dos respuestas del huésped, así como las propiedades patógenas de bacterias. Los pasos descritos en este detalle el protocolo del uso exitoso de este modelo.

Hay varios pasos críticos en este protocolo a tener en cuenta cuando se provoque colitis y el análisis de las respuestas. En primer lug...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
Caldo Luria	ABM	G247	Añadir 25 g de polvo LB a 1 litro de agua. Esterilizar en autoclave antes de usar.
Placa de fondo cuadrado con rejilla	Pescador	08 a 757-11A
Falcon tubo de cultivo	Sarstedt	62.515.006
Bombilla con punta de aguja sonda gástrica	Herramientas Artes Ciencias	18060-20
1 ml jeringa	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dextrano	Sigma	FD-4
El ácido cítrico	Sigma	C7129
Citrato de sodio	Pescador	S279-500
Dextrosa	Pescador	D16.1
Ácido citrato dextrosa			20 mM de ácido ctiric, citrato de sodio 110 mM, 5 mM de dextrosa
Negro de 96 pocillos	Pescador	07-200-762
Cuentas de metal (5 mm)	Qiagen	69989
10% de formalina	Pescador	5F93-4
5 ml vial	DiaMed	STK3205
Hematoxilina	Pescador	H345-23
Eosina	Pescador	E511-100
Xileno	Pescador	HC700-1gal
Tween 20	Sigma	P5927
Tinción Coplin tarro	VWR	47751-792
Tampón de citrato de sodio			10 mM citrato de sodio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0
Pap pluma	Cedarlane	MU22
Suero de cabra	Sigma	G902-3
Albúmina de suero bovino (BSA)	Pescador	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Sodio azida	Sigma	SZ002
El tampón de bloqueo			2% de suero de cabra, 1% BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% de Tween 20, 0,05% de sodioazida, 0,01 M PBS, pH 7,2, mezclar y almacenar a 4 º C.
Tampón de dilución de anticuerpo			0,1% de Triton X-100, 0,1% de BSA, 0,05% de azida de sodio, 0,04% de EDTA
El tampón de bloqueo y tampón de dilución de anticuerpos para tir			Recetas Igual que el anterior, pero sin la adición de detergentes (Triton X-100 y Tween 20)
Prolongar Reactivo Antifade oro con DAPI	Invitrogen	P-36931
Cubreobjetos	Pescador	12.54SE
Benchtop incubación agitador	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorómetro	Perkin Elmer	Victor2D
Centrífuga refrigerada	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Buque de vapor	Negro & Decker
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axio Image.Z1