<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

Özet

Citrobacter rodentium enfeksiyonu enterik bakteriyel enfeksiyonlar çalışma yanı sıra farelerde bağışıklık yanıtları ve kolit barındırmak için değerli bir model sunar. Bu protokol bariyer bütünlüğünü, patojen yük ve murin infeksiyöz kolit patojen ve konak katkıların tam karakterizasyonu izin histolojik hasar ölçümü özetliyor.

Özet

Bu protokol, bulaşıcı hastalığı ve ülseratif sağlam bir model üretmek için gerekli adımları, aynı zamanda farelerdeki Citrobacter rodentium enfeksiyon karakterize etmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. C. rodentium yakından klinik olarak önemli insan patojenleri enteropatojenik E. ile ilgili bir gram negatif, murin spesifik bakteriyel patojen coli ve Enterohemorrhagic E. coli. C ile bulaştıktan sonra rodentium, bağışıklık fareler mütevazı ve geçici kilo kaybı ve ishal muzdarip. Histolojik olarak, bağırsak kript uzama, bağışıklık hücre infiltrasyonu ve goblet hücre tükenmesi gözlenmektedir. Enfeksiyon Açıklık 3-4 hafta sonra elde edilir. Enfeksiyonu sonrası farklı zaman noktalarında intestinal epitel bariyeri bütünlüğünün, bakteri yükü ve histolojik hasarın ölçülmesi, enfeksiyona karşı duyarlı fare suşlarının karakterizasyonu izin verir.

Virülans mekanizmasıs bakteriyel patojenler onların ana yanı sıra, bu tür enfeksiyonlara karşı savunma özel ana yanıtların bağırsak kolonize olan göre tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, C. enterik bakteriyel enfeksiyon rodentium modeli bu süreçleri anlamamıza yardım etmek için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Enterik bakteriler de İnflamatuvar Bağırsak Hastalıkları (İnlamatuar bağırsak) ile bağlantılı olmuştur. Bu İBH hastalarında görülen uyumsuz kronik enflamatuvar yanıtları enterik bakteriler intestinal mukozal bağışıklık sisteminin anormal maruz kaldıktan sonra genetik olarak yatkın kişilerde gelişir olduğu öne sürülmektedir. Bu nedenle, enfeksiyöz kolit modelleri çalışmada enterik bakterilerin potansiyel patojen konakçı tepkileri tanımlamak için önemli bir potansiyel sunmaktadır. C. rodentium indüklenen kolit İBH patogenezinde potansiyel mekanizmaları hakkındaki bilgilerimizi geliştirerek, enterik bakterilerin konak yanıtların analizi için olanak sağlayan bir tür nadir bir modeldir;yeni önleyici ve terapötik tedavilerinin geliştirilmesi önemlidir.

Giriş

Enterik bakteriyel patojenler tarafından Enfeksiyon gastrointestinal (Gİ) iltihabı yanı sıra, ishal ve intestinal epitel bariyeri disfonksiyonu dahil intestinal patoloji ve patofizyolojisi, tetikler. Bakteriyel patojenler kendi hosts, yanı sıra enfeksiyonlara karşı savunmak belirli bir host yanıtların gastrointestinal kolonize hangi virülans mekanizmalar yeterince anlaşılmamaktadır, enterik bakteriyel enfeksiyonların modellemede Ancak son gelişmeler bu süreçleri anlamamıza yardım etmeye başlamışlardır. Enterik bakteriler de İnflamatuvar Bağırsak Hastalıkları (İnlamatuar bağırsak) ile bağlantılı olmuştur. İnlamatuar bağırsak Crohn Hastalığı (CD) ve UC kronik intestinal inflamasyon ve doku hasarı ile karakterize etyolojisi bilinmeyen karmaşık hastalıklar vardır. Böyle dekstran sodyum sülfat (DSS) ve d gibi bileşikler, kimyasal sorunlara, fareler - / - bağırsak iltihabı birçok fare modelleri, IL10 gibi genetiği değiştirilmiş suşları, spontan inflamasyon, mevcutinitrobenzene sülfonik asit (DNBS) ^1. Bu İBH hastalarında mevcut uyumsuz kronik enflamatuvar yanıtları enterik bakteriler intestinal mukozal bağışıklık sisteminin anormal pozlama ^2, bu nedenle bulaşıcı kolit modelleri çalışma aynı zamanda potansiyel patojen konak tanımlanması için önemli bir potansiyel sunmaktadır üzerine genetik olarak yatkın kişilerde gelişir olduğu öne sürülmüştür . enterik bakteriler yanıtları Citrobacter rodentium indüklenen kolit enterik bakteriler ve İBH patogenezinde olası mekanizmaların daha iyi anlaşılması için ev sahibi yanıtların analizi için izin de ^1,3 karakterize edilmiştir infeksiyöz kolit ender modellerden biridir; önemli bir adım yeni önleyici ve iyileştirici tedavileri geliştirmek.

C. rodentium yakından önemli insan ile ilgili bir (A / D) gram takılarak negatif ve effacing, murin spesifik bakteriyel patojenpatojenler enteropatojenik E. coli (EPEC) ve enterohemorajik E. coli (EHEC) ^3-8. A / E patojenlerin ailesi yakından konak hücre üzerinde bir non-invaziv kaide-benzeri bir yapı oluşturan, çekal ve kolonik epitelin apikal konak hücre zarının eklemek. C. ile Oral meydan 10 ⁸ -10 ⁹ organizmaların rodentium kript, mononükleer immün hücre infiltrasyonu ve goblet hücre tükenmesi ^3,4 kolon hiperplazi veya uzaması ile karakterize enfeksiyöz kolit sağlam bir model üretir. Kolonizasyon ilk site, birkaç saat uyarımı sonrası, çekal yama az 2 ila 3 gün enfeksiyon sonra ³ distal kolon ilerleme takip etmektedir. Immünkompetan fare suşları olarak, patojen temizlenmesi 3 ila 4 hafta enfeksiyon ^1,3,4 sonra elde edilir. Bununla birlikte, birçok genetik olarak değiştirilmiş suşları, örneğin gen eksik veya nakavt (- / -) farelerde önemli ölçüde artar göstermek için tespit edilmiştirabartılı hasar ve / veya kronik enfeksiyon ve inflamasyon ^9-14 sonuçlanan enfeksiyona yatkınlık sed. Bu nakavt suşları bu infeksiyöz kolit modelinde kullanılması, doğuştan gelen sinyal proteinlerin eksik çok, bağırsak enfeksiyonu ve inflamasyonu çözünürlüğü ayrılmaz birkaç ana proteinlerin açığa vazgeçilmez olmuştur.

Protokol

1. Citrobacter rodentium İnokulum ve Fare Oral Gavaj hazırlanması

1. Hazırlayın ve Luria Bertani broth (LB) otoklavlamayın.
2. Canlı C. edinin Steril bir inokülasyon döngü veya pipet kullanarak LB agar plaka üzerine donmuş bir gliserol stok ve çizgi gelen rodentium. 37 ° C de bir gece inkübe edin. Bir inokülasyon döngü veya pipet kullanarak LB plaka kolonileri ile bir şahinin kültürü tüp içinde steril LB broth 3 ml inoküle edin. Inokulum hazırlanması aseptik teknikler kullanılarak yapılması gerekir.
3. C. inkübe rodentium kültürü aerobik 37 ° C'de 200 rpm'de bir benchtop inkübasyon çalkalayıcı geceleme. Inoküle LB broth gecede kültürü sonra bulanık görünmelidir.
4. Bir ampul kullanın gecede C. 100 ul her fare gavaj için 1 ml şırınga bağlı gastrik gavaj iğne uçlu rodentium kültürü. Sıkıca boyun ve sırt üzerinde gevşek deri tutarak hafifçe ense fare,başparmak ve parmaklar ile. Kafasını hareketsiz ve gavaj iğne yerleştirilmesi için özofagus düzeltmek için parmağı ile hayvanın başını geriye doğru çekin.
5. Dik konumda fare koruyun ve onun ağız kenarı boyunca ve onun dil üzerinde gavaj iğne ampul ucu yönlendirin. Yavaşça ağız çatı boyunca iğne geçmek ve yemek borusu aşağı ilerlemek. Bu işlem sırasında hissettim bir direnç varsa, gavaj iğneyi çıkarın ve yeniden takın.
6. Yavaşça bakteriyel inokulum 100 ul ekleme ve yavaşça gavaj iğneyi çıkarın. Onun kafes onu döndükten sonra fare solunum hızı ve davranış izleyin.

Notlar:

• Adım 2 ve 3'te, et suyu kendisi hiçbir bakteri kirlenmesi olmasını sağlamak için gece boyunca kültive edilmesi için steril LB et suyu, 3 ml ile aseptik teknikler kullanılarak bir doğan kültür tüp hazırlanır. LB broth gecede kültürü sonrası net görünmelidir.
• yavaşça bakteri eşit dozda 4. adımda, her bir fare teslim edilir, böylece gavaj için şırınga yüklemeden önce şahin tüp içindeki kültür ajitasyon.
• Eğer 24 saat aşkın inoküle edilmiş ise gecede kültürü atılmalıdır.
• Tüm C. Enfekte hayvanların rodentium enfeksiyonları ve konut Biyogüvenlik Seviyesi 2 tesisinde yapılmalıdır.

2. C. Kolon Epitel Bariyeri Geçirgenliği Ölçüm rodentium-enfekte Fare

1. İstediğiniz zaman noktası sonrası enfeksiyon az bariyer bütünlüğünü ölçün.
2. Tahlil gününde, 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran 150 ul her bir fare için gavaj ve standart eğri hazırlamak için 80 mg ^ml-1 arasında bir konsantrasyonda salin (PBS) ile fosfat tamponlu içinde çözüldü yeterli hazırlayın.
3. FITC-dekstran 150 ul Scruff fare ve gavaj. Bu sefer kafes gıda çekin.
4. Sonra farelerde 4 saat uyuşturgavaging ve kardiyak ponksiyon yoluyla mümkün olduğunca çok kan (~ 450 ul) olarak toplamak. Pıhtılaşma engellemek için bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 3-asit sitrat dekstroz bir son konsantrasyon için kan ekleyin. Fareler Euthanize ve bakteri sayımı (adımları 3,1-3,5) için PBS içinde kolon doku toplamak ve doku fiksasyonu formalin ve sonuçta immünfloresan boyama% 10 (adımlarla 4,1-4,8) olarak.
5. 4 ° C'de santrifüj içinde 12 dakika için 1000 x g'da kan örnekleri Spin Serum toplayın ve PBS içinde 1/10 ve 1/100 seyreltilmiş. Çoğaltır içinde bir 96 plakası, bu iki dilüsyonlarda her bir numunenin 100 ul ekle.
6. Standart eğri hazırlamak için, ilk 80 mg ^ml-1 FITC-dekstran aşağıdaki konsantrasyonları için PBS içinde farelere gavajla için kullanılan seyreltik: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, ve 0 ug / ml . Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plaka için her konsantrasyon 100 ul ekle.
7. Bir uyarım wav bir flüorometre kullanılarak her bir numunenin floresans sayısal485 nm ve 535 nm emisyon dalga elength.
8. Standart eğri çizerek ham verileri analiz edin. Girdi her bir numune içinde FITC-dekstran konsantrasyonunun tespit edilmesi için standart eğri tarafından üretilen denkleminin her bir numune için ham veriler.

Notlar:

• 4. adımda itibaren, buz üzerinde kan örnekleri tutmak ve ışığa maruz kalma en aza indirmek.
• Şiddetli doku hasarına Bu noktadan sonra oluşacak bir zaman noktasında, ya da daha önce epitel bariyeri bütünlüğünün ölçerken, 7 gün sonrası enfeksiyon, en uygunudur. Ağır hasar oluşma önce bariyeri bütünlüğünün ölçülmesi C. sırasında geçirgenliği maksimal farklılıkları belirlemek için izin verir fare suşları arasındaki rodentium enfeksiyonu.
• Bulaşmamış kontrol fareler ayrıca epitel bariyeri bütünlüğünün test emin olun.

3. C. Doku Bakteriyel Yük Ölçümü rodentium-enfekte Fare

1. 1 ml steril PBS bir eklend yuvarlak boncuk bir otoklavlanmış metal aseptik teknik kullanılarak 2 ml santrifüj tüpüne netleşti. Her hayvan için toplanan bireysel dokuları ayrı PBS tüpler yerleştirilir. Doku ilave edilmeden önce, tüpleri tartılır.
2. Fare çekum ve kolon çıkarın. Kolon çekum ayırın ve forseps kullanarak lümen içeriğinin dışarı itin. PBS tüp içeriğini ekleyin. % 10 formalin fiksasyonu için distal kolon ve çekum 0.5 cm bölümleri ayırdıktan sonra, uzunlamasına kalan kolon ve çekum kesip ve tüplerde doku yerleştirmeden önce steril PBS ile yıkayın.
3. Doku ile PBS tüpleri tartılır ve daha sonra 30 Hz, 6 dakika boyunca damla çırpıcı kullanılarak örnekleri homojen hale getirilir.
4. Aseptik teknikler kullanarak, bir 96 plaka kuyu başına 180 ul steril PBS ekleyin. Her satırda ilk kuyuda her homojenize örnek 20 ul ekleyin. İyice karıştırın ve seri (ilk biz 10 ^-1 seyreltmeler elde etmek için de her önceki 20 ul ekleyerek, seyreltik10 ^-6) ll. Bir kılavuz ile kare alt LB plaka üzerinde üç nüsha halinde her örnekten her seyreltme Levha 10 ul. 37 gece inkübe ° C
5. Sonra ortalama koloni oluşturan birim (CFU), 3 sayıları sayın ve her örnek sayıldı hangi seyreltme kaydedin. Orijinal 1 ml numune 20 ul kullanıldığı gibi, 50 tarafından ortalama CFU çarpın, ve numune CFU / ml elde sayılır edildiği seyreltme faktörüyle. Son olarak, CFU / g belirlemek için doku ağırlığı ile bölün.

4. Histolojik Değerlendirilmesi ve Enfekte Kolon Dokularında immünofloresan Boyama

1. Adım 3.2 olarak dokuların toplayın. Formalin gecede Mağaza dokular, daha sonra% 70 etanol ile yıkayın. Parafin doku gömme ve boyanması için 5 mikron bölümleri kesmek. Histolojik değerlendirme için hematoksilen ve eozin ile Leke ve immünofloresan boyama için aşağıdaki adımlara devam edin.
2. Boyamadan önce dokuların deparaffinize için, yerde slaytlar65 10 dakika süreyle ° C su banyosunda bir Coplin boyama kavanoz ve koydu. Daha sonra, 2 dakika, her biri dört yıkama için ksilen içinde yer kayar. % 95 etanol,% 75 etanol ve dH _2: 0 Slaytlar bir 5 dakika sonra, aşağıdaki her yıkama, ardından% 100 etanol içinde iki adet 5 dakikalık bir yıkama, ile sulandırılır olmalıdır. Bu yıkama zararlı buharlar maruz kalmaktan kaçınmak için, bir davlumbaz yapılmalıdır.
3. 30 dakika için bir gemi içine önceden ısıtılmış sodyum sitrat tampon ve ardından yer Coplin kavanoza koyun slaytlar, sonra 30 dakika bekletin. Bu süreç protein potansiyel antijenik siteleri almak formalin fiksasyonu oluşturduğu çapraz bağlantıları keser.
4. 5 dk, üç kez PBS azid ile yıkayın. Kuru slaytlar ve doku üzerinde lokalize boyama reaktifleri tutarak, bir hidrofobik bariyer oluşturmak için bir PAP kalem ile doku çevresindeki işareti alan.
5. Bir immüno nem odasında bloke etme tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat (örneğin, α-keçi serumu) için Blok doku.
6. Prim seyreltinary antikor istenilen konsantrasyona antikor seyreltme tamponu kullanılarak. Tampon engelleme kapalı dökün ve dokulara primer antikor 50-100 ul ekleyin. 4 2 saat boyunca ° C gecede ya da oda sıcaklığında inkübe edin.
7. 5 dk, üç kez PBS azid ile yıkayın. Karanlıkta 1 saat oda sıcaklığında inkübe doku ve antikor seyreltme tamponu içinde seyreltilmiş sekonder antikor, 50-100 ul ekle. 5 dk, üç kez dH ₂ O ile yıkayın.
8. DAPI Altın montaj orta Prolong ve lamel uygulamak eklemek, slaytları kurutmak. Bir floresan mikroskop altında slaytlar görüntüle.

Notlar:

• PBS azid adım 4 itibaren, yıkama ortamı içinde bakteri büyümesini önlemek için bir alternatif olarak, taze hazırlanmış PBS ile ikame edilebilir.

Sonuçlar

Standart bir enfeksiyon deneme sırasında, fareler 100 ul gecede C. gavaj yoluyla yaklaşık 2,5 x 10 ⁸ CFU ile enfekte rodentium kültürü. C olan C57BL / 6 fareler enfeksiyonu mütevazı ve geçici kilo kaybı ve ishal rodentium sonuçlar. C57BL / 6 fareler ile nadir bir olay, hayvanlar hasta olur ve euthanization gerektirebilir rağmen. Bu nedenle, farelerin farklı suşlar enfeksiyon etkilenen ölçüde belirlemek için, kilo kaybı ve böyle piloerect kürk ve kambur...

Tartışmalar

Citrobacter rodentium enfeksiyon hastalığı ve farelerde kolit hem de çalışma için değerli bir model sağlamaktadır. Bu özgün model hem konakçı tepkileri, bakteriler gibi patojenik özellikleri karakterizasyonu için olanak sağlar. Adımlar bu protokolü detaylı olarak bu modelin başarılı kullanımı sıraladı.

Kolit ve yanıtları analiz ederken akılda tutulması gereken bu protokolü birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, bir gece boyunca taze C ha...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Luria Broth	ABM	G247	1L su ile LB toz 25 g ekleyin. Kullanmadan önce otoklav.
Grid Kare alt plaka	Balıkçı	08-757-11A
Falcon kültür tüpüne	Sarstedt	62.515.006
Ampul gastrik gavaj iğne uçlu	Güzel Bilim Araçları	18060-20
1 ml şırınga	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dekstran	Sigma	FD-4
Sitrik asit	Sigma	C7129
Sodyum sitrat	Balıkçı	S279-500
Üzüm şekeri	Balıkçı	D16.1
Asit sitrat dekstroz			20 mM ctiric asit, 110 mM sodyum sitrat, 5 mM dekstroz
Siyah 96-kuyulu plakalı	Balıkçı	07-200-762
Metal boncuk (5 mm)	Qiagen	69989
% 10 formalin	Balıkçı	5F93-4
5 ml şişe	DiaMed	STK3205
Hematoksilen	Balıkçı	H345-23
Eosin	Balıkçı	E511-100
Ksilen	Balıkçı	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Coplin boyama kavanoz	VWR	47751-792
Sodyum sitrat tampon			10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween 20, pH 6.0
Pap kalem	Cedarlane	Mu22
Keçi serumu	Sigma	G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Balıkçı	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Sodyum azid	Sigma	SZ002
Tampon Engelleme			% 2 keçi serumu,% 1 BSA,% 0.1 Triton X-100,% 0.05 Tween 20,% 0.05 sodyumazid, 0.01 M PBS, pH 7.2, 4 de mix & mağaza ° C
Antikor seyreltme tamponu			% 0.1 Triton X-100,% 0.1 BSA,% 0.05 sodyum azid,% 0.04 EDTA
Tir için engelleme tampon ve Antikor seyreltme tamponu			Yukarıda olduğu gibi, fakat deterjan ilave (Triton X-100 ve Tween 20) olmaksızın aynı tarifleri
DAPI ile Altın antifade Reaktif Prolong	Invitrogen	P-36931
Lameller	Balıkçı	12.54SE
Tezgahüstü inkübasyon çalkalayıcı	Barnstead Lab Hattı	Max Q4000
Fluorometre	Perkin Elmer	Victor2D
Soğutmalı santrifüj	Beckman Coulter	Mikrofuge'de 22R
Vapur	Black & Decker
Flüoresans mikroskobu	Zeiss	Axio Image.Z1