ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

要約

シトロrodentium感染は腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。

要約

このプロトコルは、感染症や大腸炎の堅牢なモデルを生成するために必要な手順と同様に、マウスでシトロrodentium感染を特徴付けるために使用方法を概説します。C. rodentiumは密接に臨床的に重要なヒト病原体の病原性大腸菌に関連しているグラム陰性、マウスの特定の細菌性病原体である大腸菌と腸管出血性大腸菌大腸菌 。 Cと感染時にrodentium、免疫応答性マウスは、ささやかな、一時的な体重減少と下痢に苦しんでいます。組織学的には、腸陰窩の伸長、免疫細胞の浸潤、および杯細胞の枯渇が観察される。感染のクリアランスは3〜4週間後に達成される。感染後の異なる時点で腸上皮バリアの完全性、細菌負荷、および組織学的損傷の測定は、感染に感受性マウス系統の特性評価を可能にします。

病原性機構細菌の病原体は、そのホストの腸管を植民地と同様に、このような感染症から身を守る、特定のホストの応答が十分に理解されてs。したがってC.腸内細菌感染のrodentiumモデルは 、これらのプロセスの我々の理解を助けるための貴重なツールとして機能します。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患（IBDs）にリンクされている。これは、IBD患者で見られる不適応な慢性炎症性応答が腸内細菌に腸の粘膜免疫系の異常な暴露後遺伝的に感受性の個人で開発したという仮説が立てられている。したがって、感染性大腸炎のモデルの研究では、腸内細菌への潜在的病原宿主応答を定義するための大きな可能性を提供しています。C. rodentium誘発性大腸炎は、IBDの病因の潜在的なメカニズムの理解を促進し、腸内細菌に対する宿主応答の解析が可能になり、そのような希少なモデルです。小説の予防や治療法の開発に欠かせない。

概要

腸内細菌の病原体による感染症は、下痢や腸上皮バリア機能障害を含むだけでなく腸の病理と病態生理として、消化管（GI）炎症をトリガします。細菌の病原体は、そのホストの消化管と同様に、このような感染症から身を守る特定の宿主応答を植民地になることによって病原性のメカニズムがよく理解されていない、腸内細菌感染症のモデリングでしかし最近の進歩は、これらのプロセスの理解を助けるために始めている。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患（IBDs）にリンクされている。 IBDsクローン病（CD）とUCは慢性腸の炎症や組織の損傷によって特徴付けられる原因不明の複雑な疾患である。腸炎の多くのマウスモデルは、IL10などの遺伝的に改変された菌株での自発的な炎症から、存在している - / - マウスでは、化学の課題に対するデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）やdのような化合物とinitrobenzeneスルホン酸^{（DNBS）1。}これは、IBD患者に存在する不適応な慢性炎症性応答は感染性大腸炎のモデルの研究はまた、潜在的に病原性のホストを定義するための大きな可能性を提供していますので、腸内細菌に腸管粘膜免疫系の異常被ばくによって遺伝的に感受性の個体で^2を開発^するという仮説が立てられている。腸内細菌への応答シトロrodentium誘発性大腸炎は、腸内細菌とIBDの病因の潜在的メカニズムのさらなる理解への宿主応答の解析を可能にする、よく^1,3特徴付けられている感染性大腸炎の希少なモデルの一つであり、不可欠なステップ小説予防及び治療処置を開発インチ

C. rodentiumは密接に重要なヒトに関連している（/ E）はグラム陰性取り付けると控えめ、ネズミ特有の細菌性病原体である病原体の病原性大腸菌大腸菌 （EPEC）及び腸管出血性大腸菌大腸菌 ^{（EHEC）3-8。} / Eの病原体の家族が親密に宿主細胞上の非侵襲的な台座のような構造を形成し、盲腸と結腸上皮の根尖宿主細胞膜に付着。 Cと経口チャレンジ10 ⁸ -10 ⁹生物のrodentiumは陰窩、単核球の免疫細胞浸潤および杯細胞枯渇^3,4の大腸過形成または伸長によって特徴付けられる感染性大腸炎の堅牢なモデルを生成します。植民地化の初期のサイトでは、数時間チャレンジ後、盲腸のパッチで2〜3日後に感染³遠位結腸に進行が続いています。免疫応答性マウス系統では、病原体のクリアランスは3〜4週間感染^1,3,4後に達成される。しかし、多くの遺伝的に改変された菌株、 すなわち遺伝子欠損またはノックアウト（ - / - ）マウスは、increaを表示することが見出されている誇張された損傷および/ ​​または慢性の感染症や炎症^9-14の結果感染に対する感受性をセッド。これらのノックアウト株ではこの感染性大腸炎モデルの使用は、生得的なシグナル伝達タンパク質を欠いている多くは、腸の感染症や炎症の解決に不可欠ないくつかの宿主タンパク質を明らかに不可欠となっています。

プロトコル

1。 シトロrodentium接種およびマウスの経口胃管栄養の準備

1. 準備し、オートクレーブルリアベルターニ培地（LB）。
2. 実行可能なCを得る滅菌白金耳またはピペットチップを用いてLB寒天プレート上に凍結グリセロールストックとストリークからrodentium。 37℃で一晩インキュベートする。接種ループまたはピペットチップを用いてLBプレートからコロニーを持つファルコン培養管の滅菌LB培地3 mlを接種する。接種物の調製は、無菌技術を使用して行われるべきである。
3. Cをインキュベートrodentium文化好気的に37℃、200rpmでベンチインキュベーションシェーカーで一晩。接種LBブロスは、一晩培養した後に濁って見えるはずです。
4. 一晩 、100μlの各マウスを強制経口投与した1mlシリンジに取り付け胃管栄養針をひっくり返した電球を使用して、 rodentium文化 。しっかりと首と背中の上にたるんだ皮膚をつかんで優しく首筋マウスを、親指と指を使って。頭部を固定し、強制給餌針の挿入のための食道をまっすぐに人差し指で動物の頭を後ろに引きます。
5. 直立姿勢でマウスを維持し、その口の側面に沿って、その舌の上に強制飼養針のバルブ先端を向ける。そっと口の屋根に沿って針を渡し、食道の下のそれを進める。この手順の中で感じた何らかの抵抗がある場合は、強制飼養針を取り外し、それを再挿入してください。
6. ゆっくり細菌接種の100μlを注入し、静かに強制飼養針を外します。そのケージに戻した後、マウスの呼吸と動作を監視します。

注意：

• ステップ2および3で、またスープ自体のない細菌汚染がないことを確実にするために一晩培養する無菌LBブロス3mlで無菌技術を用いて鷹の培養管を準備します。 LBブロスで一晩培養した後に明らかに表示されます。
• は静かに細菌の等しい用量は、ステップ4で、各マウスに配信されるように強制経口投与のための注射器をロードする前にファルコンチューブ内の文化を攪拌。
• それが24時間以上にわたって接種されている場合は一晩培養した培養液は捨てられるべきです。
• すべてのC. rodentiumの感染や感染動物の筐体は、バイオセーフティレベル2の施設で実施されなければならない。

2。 Cの結腸上皮関門透過性を測定するrodentium感染マウス

1. 所望の時点、感染後に障壁の完全性を測定します。
2. アッセイ当日、4 kDaのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）デキストランは150μlの各マウスを強制経口投与し、標準曲線を準備するために80ミリグラムミリリットル^-1の濃度になるように生理食塩水（PBS）に溶解し、リン酸緩衝十分な準備をします。
3. FITC-デキストラン150μlの首筋マウスと強制経口投与。この時点でケージから餌を撤回します。
4. 4時間後にマウスを麻酔gavagingと心臓穿刺を介して、できるだけ多くの血液（約450μl）のように収集しています。血液凝固を阻止するためにマイクロチューブに3パーセント酸 - クエン酸デキストロースの最終濃度に血液を追加します。マウスを安楽死させると細菌数（ステップ3.1から3.5）をPBS中結腸組織を収集し、組織固定のためにホルマリン、最終的には免疫蛍光染色10％（ステップ4.1から4.8）であった。
5. 4℃で遠心機で12分間、1,000×gで血液サンプルをスピン血清を採取し、PBS中の1/10、1/100に希釈します。複製し、96ウェルプレートに、これらの2つの希釈で各試料100μlを加える。
6. 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μg/ mlの：標準曲線を準備するには、以下の濃度になるようにPBSでマウスを強制経口投与するために使用した元の80ミリグラムml ^-1の FITC-デキストランを薄める。三重で96ウェルプレートに各濃度の100μlを添加する。
7. wavファイルで励起蛍光光度計を用いて、各サンプルの蛍光を定量485nmおよび535nmの発光波長のelength。
8. 標準曲線をプロットすることにより、生データを分析します。入力各サンプル中のFITC-デキストランの濃度を決定するために標準曲線によって生成された直線の方程式に各サンプルの生データ。

注意：

• 手順4以降では、氷の上に血液サンプルを保持し、光への曝露を最小限に抑えます。
• 重篤な組織損傷がこのポイントの後に発生するようにした時点で、または前に上皮バリアの完全性を測定する場合は、7日後の感染症は、最適です。深刻な被害が出現する前に、障壁の完全性を測定することは、あなたが Cの間に透磁率の最大の違いを判別することができマウス系統間でrodentium感染 。
• 感染していないコントロールマウスも上皮バリアの完全性のためにテストされていることを確認します。

3。 Cの組織における細菌負荷の測定rodentium感染マウス

1. 1ミリリットル滅菌PBS追加ndはラウンドビーズオートクレーブした金属は無菌操作を用いて、2 mlの遠心チューブを底を打った。各動物から採取した個々の組織は、別々のPBSのチューブ内に配置されます。組織の添加前にチューブの重量を量る。
2. マウスの盲腸および結腸を削除します。結腸から盲腸を分離し、鉗子を用いて管腔内容物を押し出す。 PBSのチューブにコンテンツを追加します。 10％ホルマリン固定のために遠位結腸と盲腸から0.5cmのセクションを分離した後、縦方向に残存結腸と盲腸を開き、チューブに組織を配置する前に、滅菌PBSで洗浄カット。
3. 組織をPBSチューブを計量した後、30 Hzで6分間ビーズビーターを使用してサンプルをホモジナイズする。
4. 無菌技術を用いて、96ウェルプレートにウェル当たり180μlの滅菌PBSを追加します。各行の最初のウェルに各均質化したサンプル20μlを添加する。よく混和して、連続的に希釈し、10 ^-1（最初の我々から希釈液を得るために、各ウェル以前から20μlを添加10 ^{-6〜LL）。}グリッド付きの正方形の底のLBプレートに三連で各試料からの各希釈液10μlをプレート。 37℃で一晩インキュベート℃、
5. 次に平均コロニー形成単位（CFU）、3カウントを数えて、各サンプルがカウントされたときの希釈を記録します。オリジナル1mlの試料20μlを使用したのと、50で平均CFUを掛けて、サンプルはCFU / mlで、結果としてカウントされたときの希釈率。最後に、CFU / gを決定するために組織重量で割る。

4。組織学的評価と感染結腸組織の免疫蛍光染色

1. ステップ3.2のように組織を採取します。ホルマリンで一晩ストア組織は、その後、70％エタノールで洗浄してください。パラフィンの組織を埋め込むと染色に5μmの切片を切った。組織学的評価のためにヘマトキシリン​​·エオシン染色および免疫蛍光染色のため、次のステップに進みます。
2. 場所のスライドで、前染色組織を脱パラフィンする65 10分間℃の水浴中でコプリン染色壺を置く。次に、2分間ずつ4回の洗浄のためにキシレンのプレーススライド。 95％エタノール、75％エタノールとdH ₂ 0：スライドは、次のそれぞれに1 5分間洗浄に続いて100％エタノールで2つの5分間の洗浄、再水和されるべきである。これらの洗浄は有害な蒸気への暴露を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。
3. あらかじめ温めておいたクエン酸ナトリウム緩衝液、その後30分間蒸し器に場所とコプリンジャーに入れ、スライドは、その後30分間放置します。このプロセスは、潜在的な抗原部位を取り出すホルマリン固定により形成されたタンパク質のクロスリンクが解除されます。
4. 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。 PAPのペンで組織の周りに乾いたスライドやマーク領域は、組織に局在染色試薬を維持し、疎水性の障壁を作成することができます。
5. 免疫染色水分チャンバ内のブロッキングバッファーを用いて室温で1時間（ 例えば 、α-ヤギ血清）のブロック組織。
6. 堅苦しい薄める抗体希釈バッファーを使用して所望の濃度に進抗体。ブロッキングバッファーを捨て、組織に一次抗体を50から100μlを添加する。 2時間4℃で一晩または室温でインキュベートする。
7. 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。暗闇の中で1時間室温でインキュベートする組織や抗体希釈バッファーで希釈した二次抗体の50〜100μlを添加する。 5分間、3回のdH ₂ Oで洗浄します。
8. DAPIはゴールドマウント培地を延長し、カバースリップを適用追加、スライドを脱水。蛍光顕微鏡下でスライドを表示します。

注意：

• PBSアジドは、ステップ4以降の洗浄培地で細菌の増殖を回避するための代替として新たに調製し、PBSで置換することができる。

結果

標準的な感染実験では、マウスは、100μlの一晩の強制経口投与によって、約2.5×10 ⁸ CFUに感染しているrodentium文化 。 CとC57BL / 6マウスの感染ささやかな、一時的な体重減少と下痢でrodentium結果 。 C57BL / 6マウスを持つまれな出来事が、動物が病気になると安楽死が必要な場合があります。したがって、マウスは異なる株が感染症の影響を受けている程度を判?...

ディスカッション

シトロrodentium感染は、感染症およびマウスにおける大腸炎の両方を研究するための貴重なモデルを提供します。このユニークなモデルは、両方のホストの応答だけでなく、細菌の病原性の性質の特徴付けを可能にします。手順では、このプロトコルの詳細は、このモデルの成功した使用を概説した。

大腸炎を誘発し、応答を解析するときに留意すべきは、このプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
L培地	ABM	G247	1リットルの水にLBの粉末25グラムを追加します。使用前にオートクレーブ。
グリッド付きの正方形の底板	フィッシャー	08から757-11A
ファルコン培養管	ザルスタット	62.515.006
電球は胃管栄養針をひっくり返した	ファイン科学ツール	18060から20
1mlシリンジ	BD Biosciences社	309659
4 kDaのFITC-デキストラン	シグマ	FD-4
クエン酸	シグマ	C7129
クエン酸ナトリウム	フィッシャー	S279-500
葡萄糖	フィッシャー	D16.1
クエン酸デキストロース			20mMのctiric酸、110mMのクエン酸ナトリウム、5 mMのブドウ糖
黒色96ウェルプレート	フィッシャー	07-200-762
メタルビーズ（5mm）を	キアゲン	69989
10％ホルマリン	フィッシャー	5F93-4
5mlのバイアル	DiaMed	STK3205
ヘマトキシリン	フィッシャー	H345-23
エオシン	フィッシャー	E511-100
キシレン	フィッシャー	HC700-1GAL
ツイーン20	シグマ	P5927
コプリン染色瓶	VWR	47751-792
クエン酸ナトリウム緩衝剤			10mMのクエン酸ナトリウム、0.05％ツイーン20、pH6.0の
パパニコロウペン	Cedarlane	Mu22
ヤギ血清	シグマ	G902-3
ウシ血清アルブミン（BSA）	フィッシャー	BP1600-100
トリトンX-100	シグマ	T8532
アジ化ナトリウム	シグマ	SZ002
ブロッキングバッファーを			2％ヤギ血清、1％BSA、0.1％トリトンX-100、0.05％のTween20、0.05％ナトリウムアジ化ナトリウム、0.01MのPBS、pH7.2中、4でミックス＆℃で保存
抗体希釈バッファー			0.1％トリトンX-100、0.1％BSA、0.05％アジ化ナトリウム、0.04％EDTAを
TIR用のブロッキングバッファー＆抗体希釈バッファー			上記のようにしますが、洗剤の添加（トリトンX-100、Tween 20）でなくても同じレシピ
DAPIでゴールド褪色防止試薬を延長	インビトロジェン	P-36931
カバースリップ	フィッシャー	12.54SE
ベンチインキュベーションシェーカー	Barnsteadラボライン	マックスQ4000
蛍光光度計	パーキンエルマー	Victor2D
冷凍遠心器	ベックマン·コールター	微量22R
蒸し器	ブラック＆デッカー
蛍光顕微鏡	ツァイス	アクシオImage.Z1