La<em&gt; Citrobacter rodentium</emModèle de souris&gt;: Étudier Contributions des agents pathogènes et l&#39;hôte de la colite infectieuse

Résumé

Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude des infections bactériennes entériques ainsi que l'hôte réponses immunitaires et la colite chez la souris. Ce protocole décrit la mesure du intégrité de la barrière, la charge de pathogènes et les dommages histologiques permettant la caractérisation approfondie des contributions pathogène et de l'hôte à la colite infectieuse murin.

Résumé

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour produire un modèle robuste d'une maladie infectieuse et la colite, ainsi que les méthodes utilisées pour caractériser l'infection Citrobacter rodentium chez la souris. C. rodentium est une gram négatif, murin pathogène spécifique bactérienne qui est étroitement liée à l'importance clinique humaine entéropathogène pathogènes E. coli entérohémorragique et E. coli. Lors de l'infection à C. rodentium, souris immunocompétentes souffrent de la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Histologiquement, l'allongement crypte intestinale, l'infiltration de cellules immunitaires, et l'épuisement des cellules caliciformes sont observées. Garde d'infection est atteinte après 3 à 4 semaines. Mesure de l'intégrité barrière épithéliale intestinale, la charge bactérienne, et les dommages histologiques à différents moments après l'infection, permettent la caractérisation des souches de souris sensibles à l'infection.

Le mécanisme de virulences par des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l'hôte qui défendent contre de telles infections sont mal compris. Par conséquent, le C. rodentium modèle d'infection bactérienne entérique constitue un outil précieux pour aider à la compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Il a été émis l'hypothèse que les réponses inflammatoires chroniques inadaptés observés chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles après une exposition anormale du système immunitaire intestinal des muqueuses à des bactéries entériques. Par conséquent, l'étude des modèles de colite infectieuse offre un potentiel important pour la définition potentiellement pathogènes réponse de l'hôte aux bactéries entériques. C. rodentium colite induite est un modèle du genre rare qui permet l'analyse des réponses de l'hôte aux bactéries entériques, approfondir notre compréhension des mécanismes potentiels de la pathogenèse du commerce international;essentiel dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.

Introduction

L'infection par des bactéries pathogènes entériques déclenche gastro-intestinal (GI) l'inflammation, ainsi que pathologie intestinale et la physiopathologie, y compris la diarrhée intestinale et dysfonction de la barrière épithéliale. Les mécanismes de virulence des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus gastro-intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l'hôte qui défendent contre de telles infections sont mal comprises, mais les progrès récents dans la modélisation des infections entériques bactériennes ont commencé à nous aider dans notre compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Maladie de Crohn Le MII (CD) et UC sont des maladies complexes d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation intestinale chronique et des lésions tissulaires. De nombreux modèles murins d'inflammation intestinale existent, d'une inflammation spontanée des souches génétiquement modifiés, tels que l'IL10 - / - souris, aux défis chimiques avec des composés tels que le sulfate de dextrane sodique (DSS) et dinitrobenzene sulfonique (DNBS) ^1. Il a été émis l'hypothèse que les réponses inadaptées chroniques inflammatoires présentes chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles à l'exposition anormale du système immunitaire intestinal muqueuse de bactéries entériques ^2, donc l'étude des modèles de colite infectieuse offre également un potentiel important pour la définition de l'hôte potentiellement pathogène . réponses à des bactéries entériques Citrobacter rodentium colite induite est l'un des rares modèles de colite infectieuse qui a été bien caractérisés ^1,3, ce qui permet l'analyse des réponses de l'hôte aux bactéries entériques et de la compréhension de nouveaux mécanismes potentiels de la pathogenèse de MICI, une étape essentielle dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.

C. rodentium est une gram négatif attachant et effaçant (A / E), murin pathogène bactérien spécifique qui est étroitement liée à l'humain importantentéropathogène pathogènes E. coli (EPEC) et entérohémorragique E. coli (EHEC) ^3-8. La famille d'un des agents pathogènes / E intimement joindre à la membrane de la cellule hôte apicale de l'épithélium du caecum et du côlon, la formation d'un non-invasive piédestal structure en forme de la cellule hôte. Provocation par voie orale avec C. rodentium de 10 ⁸ -10 ⁹ organismes produisant un modèle robuste d'une colite infectieuse caractérisée par une hyperplasie du côlon ou de l'allongement des cryptes, infiltration mononucléaire cellules immunitaires et l'épuisement des cellules caliciformes ^3,4. Le site initial de la colonisation, quelques heures après la provocation, est le patch du caecum, suivie par une progression dans le côlon distal 2 à 3 jours après l'infection ^3. Dans souches de souris immunocompétentes, l'élimination de l'agent pathogène est atteinte 3 à 4 semaines après l'infection ^1,3,4. Cependant, de nombreuses souches génétiquement modifiés, c.-à-gène déficient ou KO (- / -) des souris, ont été trouvés pour afficher augsed susceptibilité à l'infection causant des dommages exagérés et / ou d'une infection chronique et l'inflammation ^9-14. L'utilisation de ce modèle de colite infectieuse chez ces souches huitièmes de finale, beaucoup manquent innées protéines de signalisation, a été indispensable pour révéler plusieurs protéines de l'hôte faisant partie intégrante de la résolution de l'infection et de l'inflammation intestinale.

Protocole

1. Préparation de l'inoculum et Citrobacter rodentium gavage de souris

1. Préparer et passer à l'autoclave Luria Bertani (LB).
2. Obtenir viable C. rodentium à partir d'un stock de glycerol congelé et sans stries sur gélose LB à l'aide d'une anse stérile inoculation ou de pointe de la pipette. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Inoculer 3 ml de bouillon LB stérile dans un tube de culture faucon avec des colonies de la plaque de LB en utilisant une boucle d'inoculation ou de pointe de la pipette. Préparation de l'inoculum doit être fait en utilisant des techniques aseptiques.
3. Incuber la C. culture rodentium en aérobiose à 37 ° C pendant la nuit dans une incubation de table agitateur à 200 tpm. Le bouillon LB inoculé devrait apparaître nuageux après une nuit de culture.
4. Utilisez une ampoule à pointe aiguille de gavage gastrique attachée à une seringue de 1 ml à chaque souris gavage avec 100 ul de la nuit C. rodentium culture. Doucement nuque de la souris, en tenant fermement la peau lâche sur son cou et le dosavec le pouce et les doigts. Tirez la tête de l'animal avec votre index pour immobiliser la tête et redresser l'œsophage pour l'insertion de l'aiguille de gavage.
5. Maintenir la souris dans une position verticale et de diriger la pointe de l'aiguille ampoule gavage sur le côté de sa bouche et sur sa langue. Doucement passer l'aiguille sur le toit de la bouche et le faire avancer dans l'œsophage. S'il ya une résistance ressentie lors de cette procédure, retirez l'aiguille gavage et réinsérez-le.
6. Lentement, injecter 100 ml de l'inoculum bactérien et retirez délicatement l'aiguille de gavage. Surveiller le rythme de la respiration et le comportement de la souris après le retourner à sa cage.

Notes:

• Dans les étapes 2 et 3, également préparer un tube de culture en utilisant des techniques aseptiques faucon avec 3 ml de bouillon LB stérile pour être cultivées pendant une nuit pour s'assurer qu'il n'y ait pas de contamination bactérienne du bouillon lui-même. Le bouillon LB doit être limpide après une nuit de culture.
• Agiter doucement la culture dans le tube falcon avant le chargement des seringues pour gavage sorte qu'une dose égale de bactéries est remis à chaque souris, à l'étape 4.
• Culture d'une nuit doit être jeté s'il a été vacciné depuis plus de 24 heures.
• Toutes C. rodentium infections et de logement des animaux infectés doivent être effectuées dans un centre de biosécurité de niveau 2.

2. Mesure de la perméabilité colique barrière épithéliale en C. rodentium souris infectées

1. Mesurer intégrité de la barrière à un moment souhaité après l'infection.
2. Le jour de l'essai, préparer suffisamment de 4 kDa isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextrane dissous dans un tampon phosphate salin (PBS) à une concentration de 80 ^-1 mg ml à chaque souris gavage avec 150 pi et de préparer la courbe d'étalonnage.
3. Scruff la souris et le gavage avec 150 ul de FITC-dextran. Retirer la nourriture de la cage pour le moment.
4. Anesthésier les souris 4 heures aprèsgavage et de recueillir autant de sang que possible (~ 450 pi) par ponction cardiaque. Ajouter le sang à une concentration finale de 3% d'acide citrate dextrose dans un microtube pour empêcher la coagulation. Euthanasier les souris et recueillir des tissus du côlon chez PBS pour le nombre de bactéries (étapes 3,1 à 3,5) et dans 10% de formol pour la fixation des tissus et, finalement, l'immunofluorescence (étapes 4,1 à 4,8).
5. Faites tourner les échantillons de sang à 1000 xg pendant 12 min dans une centrifugeuse à 4 ° C. Recueillir le sérum et diluer à 1/10 et 1/100 dans du PBS. Ajouter 100 ul de chaque échantillon à ces deux dilutions sur une plaque de 96 puits dans répétitions.
6. Pour préparer la courbe d'étalonnage, diluer l'original 80 mg ml ^-1 FITC-dextran utilisé pour gavage des souris dans du PBS pour les concentrations suivantes: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, et 0 pg / ml . Ajouter 100 ul de chaque concentration à une plaque de 96 puits en trois exemplaires.
7. Quantifier la fluorescence de chaque échantillon à l'aide d'un fluorimètre à une excitation wavelength de 485 nm et de longueur d'onde d'émission de 535 nm.
8. Analyser les données brutes en traçant la courbe standard. Saisissez les données brutes de chaque échantillon dans l'équation de la droite engendrée par la courbe standard pour déterminer la concentration de FITC-dextran dans chaque échantillon.

Notes:

• Partir de l'étape 4 et suivants, conserver des échantillons de sang sur la glace et de minimiser l'exposition à la lumière.
• Lors de la mesure intégrité de la barrière épithéliale un point dans le temps, ou avant, 7 jours post-infection est optimale, car de graves lésions tissulaires partir de cet instant. Mesure intégrité de la barrière avant se produise des dommages graves vous permet de déterminer les différences maximales de perméabilité au cours de C. infection rodentium entre les souches de souris.
• Assurez-vous que les souris témoins non infectés sont également testés pour intégrité de la barrière épithéliale.

3. Mesure de la charge bactérienne dans les tissus de C. rodentium souris infectées

1. Ajouter 1 ml de PBS stérile d'une un métal autoclave talon à fond rond d'un tube de 2 ml centrifugeuse utilisant une technique aseptique. Les différents tissus prélevés sur chaque animal seront placés dans des tubes séparés PBS. Peser les tubes avant l'addition du tissu.
2. Retirez le caecum et le côlon de la souris. Séparer le caecum du côlon et poussez le contenu luminal à l'aide de pinces. Ajouter le contenu d'un tube de PBS. Après séparation de 0,5 cm sections de la partie distale du côlon et du caecum pour la fixation au formol à 10%, couper le reste du côlon et du caecum longitudinalement et laver avec du PBS stérile avant de les placer dans des tubes de tissus.
3. Peser les tubes PBS avec le tissu, puis homogénéiser les échantillons à l'aide d'un fouet perles pendant 6 min à 30 Hz.
4. En utilisant des techniques aseptiques, ajouter 180 ul de PBS stérile par puits d'une plaque 96 puits. Ajouter 20 ul de chaque échantillon homogénéisé au premier puits de chaque rangée. Bien mélanger et diluer en série, en ajoutant 20 pl de chaque précédente ainsi d'obtenir des dilutions de 10 ^-1 (d'abord nousll) à 10 ^-6. Planche 10 ul de chaque dilution de chaque échantillon en triple sur une plaque LB fond carré avec une grille. Incuber une nuit à 37 ° C.
5. Comptez unités formant colonies (UFC), puis la moyenne des 3 chefs, et d'enregistrer la dilution à laquelle chaque échantillon a été compté. Multipliez moyenne UFC par 50, comme 20 pl de l'original 1 ml d'échantillon a été utilisé, et par le facteur de dilution à laquelle l'échantillon a été compté résultant en UFC / ml. Finalement, diviser par la masse de tissu afin de déterminer UFC / g.

4. Évaluation histologique et la coloration par immunofluorescence de tissus infectés Colon

1. Recueillir des tissus comme à l'étape 3.2. Boutique de tissus dans le formol durant la nuit, puis laver avec de l'éthanol à 70%. Intégrer les tissus en paraffine et coupé 5 sections um pour la coloration. Tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour évaluation histologique et procéder aux étapes suivantes pour immunofluorescence.
2. Pour Déparaffiner tissus avant la coloration, le lieu glisse dansune cuvette Coplin et mettre en bain d'eau à 65 ° C pendant 10 min. Ensuite, placer les lames dans du xylène pendant quatre lavages de 2 minutes chacun. Les lames doivent être réhydratés avec deux 5-minute lavages dans de l'éthanol 100%, suivi par une 5 min de lavage dans chacune des catégories suivantes: éthanol 95%, éthanol à 75% et dH ₂ 0. Ces lavages doit être effectuée sous une hotte pour éviter l'exposition à des vapeurs nocives.
3. Placer les lames dans la jarre Coplin avec préchauffé tampon citrate de sodium, puis le placer dans un bateau à vapeur pendant 30 min, puis laisser reposer 30 min. Ce processus rompt la réticulation de la protéine formée par la fixation au formol récupérer sites antigéniques potentiels.
4. Laver avec du PBS azide pendant 5 min, trois fois. Lames sèches et la zone autour du tissu marque avec un stylo PAP pour créer une barrière hydrophobe, en gardant les réactifs de coloration localisés sur le tissu.
5. Bloquer les tissus pendant 1 heure à température ambiante avec un tampon de blocage (par exemple α-sérum de chèvre) dans une chambre humide immunomarquage.
6. Diluer primary anticorps à la concentration souhaitée à l'aide du tampon de dilution d'anticorps. Verser tampon bloquant et ajouter 50 à 100 ul de l'anticorps primaire dans les tissus. Incuber à 4 ° C pendant la nuit ou à la température ambiante pendant 2 heures.
7. Laver avec du PBS azide pendant 5 min, trois fois. Ajouter 50-100 ul d'anticorps secondaire dilué dans un tampon de dilution d'anticorps dans les tissus et les incuber à température ambiante pendant 1 heure dans l'obscurité. Laver avec dH ₂ O pendant 5 minutes, trois fois.
8. Déshydrater les lames, ajouter DAPI Prolongez moyen d'or de montage et recouvrir d'une lamelle. Afficher les diapositives sous un microscope à fluorescence.

Notes:

• PBS azide peut être substitué par du PBS fraîchement préparé comme alternative pour éviter la prolifération bactérienne dans le milieu de lavage provenant de l'étape 4 en avant.

Résultats

Au cours d'une expérience d'infection standard, les souris sont infectées avec environ 2,5 x 10 ⁸ UFC par gavage de 100 pi C pendant une nuit rodentium culture. L'infection des souris C57BL / 6 avec C. rodentium résultats dans la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Bien que rare avec souris C57BL / 6, les animaux peuvent tomber malades et nécessitent l'euthanasie. Par conséquent, les souris doivent être surveillés pour le degré de perte ...

Discussion

Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude de deux maladies infectieuses et de la colite chez la souris. Ce modèle unique permet de caractériser des réponses de l'hôte, ainsi que les propriétés pathogènes de bactéries. Les étapes décrites dans ce protocole détail l'utilisation réussie de ce modèle.

Il ya plusieurs étapes critiques de ce protocole à garder à l'esprit lors de l'induction de colite et de l'analys...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Luria Broth	ABM	G247	Ajouter 25 g de poudre de LB pour 1L d'eau. Autoclave avant d'utiliser.
Plaque de fond carrée avec grille	Pêcheur	08 à 757-11A
Tube de culture Falcon	Sarstedt	62.515.006
Ampoule à pointe aiguille de gavage gastrique	Outils Fine Science	18060-20
Seringue de 1 ml	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dextran	Sigma	FD-4
Acide citrique	Sigma	C7129
Le citrate de sodium	Pêcheur	S279-500
Dextrose	Pêcheur	D16.1
Acide citrate dextrose			20 mM d'acide ctiric, 110 mM de citrate de sodium, 5 mM de dextrose
Noir Plaque 96 puits	Pêcheur	07-200-762
Perles en métal (5 mm)	Qiagen	69989
Formol à 10%	Pêcheur	5F93-4
Flacon de 5 ml	DiaMed	STK3205
Hématoxyline	Pêcheur	H345-23
Eosine	Pêcheur	E511-100
Xylène	Pêcheur	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Cuve de coloration Coplin	VWR	47751-792
Tampon citrate de sodium			10 mM de citrate de sodium, 0,05% Tween 20, pH 6,0
Stylo Pap	Cedarlane	Mu22
Sérum de chèvre	Sigma	G902-3
Albumine de sérum bovin (BSA)	Pêcheur	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
L'azoture de sodium	Sigma	SZ002
Tampon de blocage			2% de sérum de chèvre, 1% BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% de sodiumazide, PBS 0,01 M, pH 7,2, mélanger et conserver à 4 ° C.
Tampon de dilution d'anticorps			0,1% de Triton X-100, 0,1% de BSA, 0,05% d'azoture de sodium, 0,04% d'EDTA
Tampon de blocage tampon de dilution et d'anticorps pour tir			Mêmes recettes que ci-dessus, mais sans addition de détergents (Triton X-100 et Tween 20)
Prolongez réactif Antifade or avec DAPI	Invitrogen	P-36931
Lamelles de	Pêcheur	12.54SE
Incubation de table shaker	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorimètre	Perkin Elmer	Victor2D
Centrifugeuse réfrigérée	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Bateau à vapeur	Black & Decker
Microscope à fluorescence	Zeiss	Axio Image.Z1