<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: изучение патогенности и Хост Взносы в инфекционным колитом

Резюме

Citrobacter rodentium инфекции предоставляет ценную модель для изучения кишечных бактериальных инфекций, а также иммунный ответ и колита у мышей. Этот протокол описывает измерение барьер целостности, патогенов и гистологическое повреждение позволяет тщательно характеристика возбудителя и принимающих вклады в мышиной инфекционных колитах.

Аннотация

Этот протокол описывает шаги, необходимые для создания надежной модели инфекционного заболевания и колитах, а также методы, используемые для характеристики Citrobacter rodentium инфекции у мышей. C. rodentium представляет собой грамотрицательные, мышиный конкретных бактериальных патогенов, которые тесно связаны с клинически значимых патогенов человека энтеропатогенных E. палочки и Энтерогеморрагическая E. палочки. После инфицирования C. rodentium, иммунокомпетентных мышей страдают от скромных и переходные потери веса и диареи. Гистологически, кишечных удлинение склеп, иммунной клеточной инфильтрации и истощения бокаловидных клеток не наблюдается. Оформление инфекции достигается после 3 до 4 недель. Измерение кишечного эпителия целостности барьера, бактериальной нагрузки, и гистологическое повреждение в различные моменты времени после заражения, позволяющие характеристика штаммов мыши восприимчивы к инфекции.

Механизм вирулентностис помощью которых патогенные бактерии колонизировать желудочно-кишечного тракта их хозяев, а также конкретные ответы хоста, защититься от таких инфекций мало изучены. Поэтому C. rodentium модели кишечной бактериальной инфекции служит ценным инструментом, чтобы помочь в нашем понимании этих процессов. Кишечные бактерии также были связаны с Воспалительные заболевания кишечника (IBDs). Она была выдвинута гипотеза о том, что неадекватные хронические воспалительные реакции наблюдаются у пациентов IBD развиваются у генетически предрасположенных лиц после ненормального воздействия на слизистой кишечника иммунной системы кишечных бактерий. Таким образом, изучение моделей инфекционного колита имеет значительный потенциал для определения потенциально патогенных ответы принимающей кишечных бактерий. C. rodentium индуцированный колит является одним из таких редких моделей, что позволяет проводить анализ принимающих ответы на кишечные бактерии, углубления нашего понимания возможных механизмов патогенеза IBD;важную роль в разработке новых профилактических и лечебных процедур.

Введение

Заражение кишечными бактериальными патогенами вызывает желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) воспаления, а также кишечной патологии и патофизиологии, в том числе диарея и кишечные эпителиальные дисфункции барьера. Вирулентности механизмы, с помощью которых патогенные бактерии колонизировать желудочно-кишечного тракта их хозяев, а также конкретные ответы хоста, защититься от таких инфекций, плохо понимается, однако последние достижения в области моделирования кишечных бактериальных инфекций начали помогать нашему пониманию этих процессов. Кишечные бактерии также были связаны с Воспалительные заболевания кишечника (IBDs). Болезнь IBDs Крона (БК) и UC являются сложными заболеваниями неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим кишечным воспалением и повреждением тканей. Многие модели мыши кишечного воспаления существуют, от спонтанного воспаления у генетически модифицированные штаммы, такие как IL10 - / - мышей, химических проблем с соединениями, такими как декстран сульфат натрия (DSS) и гinitrobenzene кислоты (DNBS) ^1. Она была выдвинута гипотеза о том, что неадекватные хронических воспалительных реакций присутствует у пациентов IBD развиваются у генетически предрасположенных лиц по ненормального воздействия на слизистой кишечника иммунной системы кишечных бактерий ^2, поэтому исследование модели инфекционного колита также имеет значительный потенциал для определения потенциально патогенных хоста . ответы на кишечные бактерии Citrobacter rodentium индуцированный колит является одним из самых редких моделей инфекционных колитах, которые были охарактеризованы ^1,3, что позволяет при анализе ответов на множество кишечных бактерий и дальнейшего понимания возможных механизмов патогенеза IBD; важным шагом В разработке новых профилактических и лечебных процедур.

C. rodentium является грамотрицательные крепления и скромный (A / E), мышиный конкретных бактериальных патогенов, которые тесно связаны с важными человекапатогенных энтеропатогенных E. палочка (EPEC) и энтерогеморрагическая E. палочка (EHEC) ^3-8. Семейство / E патогенных тесно приложить к апикальной мембране клетки-хозяина из слепой кишки и ободочной эпителия, образуя неинвазивной пьедестал подобные структуры на клетке-хозяине. Устные проблема с C. rodentium из 10 ⁸ -10 ⁹ организмов создает надежную модель инфекционного колита характеризуется толстой гиперплазии или удлинение склепы, мононуклеарными иммунной клеточной инфильтрации и бокаловидных клеток истощения ^3,4. Начальный участок колонизации, за несколько часов после заражения, находится в слепой патч, затем прогрессии дистального отдела толстой кишки от 2 до 3 дней после заражения ^3. В иммунокомпетентных линий мышей, оформление возбудителя осуществляется от 3 ​​до 4 недель после заражения ^1,3,4. Тем не менее, многие генетически модифицированные штаммы, т.е. ген недостаточной или нокаут (- / -) мышей, были найдены просмотров increaСЭД восприимчивость к инфекции в результате преувеличенного ущерба и / или хронической инфекцией и воспалением ^9-14. Использование этой модели инфекционного колита в этих нокаутом штаммов, многие не хватает врожденной сигнальных белков, был незаменимым в выявлении нескольких белков, принимающих неотъемлемой разрешения кишечной инфекции и воспаления.

протокол

1. Подготовка Citrobacter rodentium посевной и желудочный зонд мышей

1. Подготовка и стерилизации Лурия Bertani бульон (LB).
2. Получение жизнеспособного C. rodentium из замороженного запаса глицерина и подряд на LB агаром с помощью стерильного посева петлю или пипетки. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи. Инокулировать 3 мл стерильного бульона LB в трубке сокол культуре колоний от LB пластины с использованием прививки петли или пипетки. Подготовка к посевной должно быть сделано с использованием асептических методов.
3. Инкубируйте C. rodentium культуру аэробных условиях при 37 ° C в течение ночи в инкубационный настольных шейкер при 200 оборотах в минуту. Инокулированных LB бульоне должна появиться облачно после ночной культуры.
4. Используйте лампочки наконечником желудка через зонд иглой в 1 мл шприц с зондовым каждой мыши с 100 мкл в течение ночи C. rodentium культуры. Аккуратно шкирку мыши,, крепко держа дряблая кожа на шее и спинес большим пальцем и пальцами. Потяните голову животного с указательным пальцем, чтобы обездвижить голову и выпрямите пищевода для введения через желудочный зонд иглы.
5. Поддерживать мыши в вертикальном положении и направлять лампу кончике иглы через желудочный зонд вдоль стороны его рта и над его языком. Аккуратно пройти иглой по небу и продвигать его вниз по пищеводу. Если есть сопротивление чувствовал во время этой процедуры, удалить зонд иглу и вставьте ее снова.
6. Медленно вводят 100 мкл бактериальной посевной и осторожно извлеките иглу через желудочный зонд. Монитор скорости дыхания и поведение мышей после возвращения его в клетку.

Примечания:

• В шаги 2 и 3, а также подготовить трубки сокола культуры с использованием асептических методов с 3 мл стерильного бульона LB быть культивировали в течение ночи, чтобы убедиться, что нет бактериального загрязнения бульона себя. LB бульоне должна появиться ясно после ночной культуры.
• Аккуратно перемешивать культуру внутри трубки сокола перед загрузкой шприцы для введения через желудочный зонд, так что равные дозы бактерий доставляется в каждую мышь, в шаге 4.
• Ночь культуры должны быть отброшены, если она была сделана прививка в течение 24 часов.
• Все C. rodentium инфекции и жилищных зараженных животных должно осуществляться в Уровень безопасности 2 объекта.

2. Измерение Кишечное эпителиальной проницаемости барьера в C. rodentium-инфицированных мышей

1. Измерение целостности барьера в нужный момент времени после заражения.
2. В день анализа, подготовки достаточно 4 кДа изотиоцианат флуоресцеина (FITC)-декстран растворяют в фосфатном буферном растворе (PBS) до концентрации 80 мг мл ^-1 до зондовым каждой мыши с 150 мкл и подготовить по стандартной кривой.
3. Scruff мыши и через зонд 150 мкл FITC-декстрана. Вывод пищу из клетки в это время.
4. Anesthetize мышей 4 часа послеgavaging и собирать столько крови, сколько возможно (~ 450 мкл) путем пункции сердца. Добавить крови до конечной концентрации 3% кислотно-цитрат декстрозы в микроцентрифуге трубки для предотвращения свертывания крови. Усыпить мышей и собирать толстой ткани в PBS для бактерий (шаг 3,1 - 3,5) и в 10% формалине для фиксации тканей и в конечном итоге иммунофлуоресцентного окрашивания (шаг 4,1 - 4,8).
5. Побочные образцы крови в 1000 х г в течение 12 мин в центрифуге при 4 ° C. Сбор сыворотки и разбавить до 1/10 и 1/100 в PBS. Добавить 100 мкл каждого образца в этих двух разведений в 96-луночный планшет в репликации.
6. Для получения стандартной кривой, разбавить оригинальные 80 мг мл ^-1 FITC-декстрана используются для зондовым мышей в PBS в следующих концентрациях: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 мкг / мл . Добавить 100 мкл каждой концентрации в 96-луночный планшет в трех экземплярах.
7. Количественная флуоресценции каждого образца с помощью флуорометре в возбуждении WAVelength из 485 нм и 535 нм длина волны излучения.
8. Анализ исходных данных путем построения стандартной кривой. Введите исходные данные для каждого образца в уравнение прямой, порожденной стандартной кривой для определения концентрации FITC-декстрана в каждом образце.

Примечания:

• Из пункта 4 вперед, держать образцы крови на льду и свести к минимуму воздействие света.
• При измерении целостности эпителиального барьера момент времени, в, или до 7 дней после заражения является оптимальным, так как серьезные повреждения ткани происходит после этого. Измерение целостности барьера до тяжелой встречающиеся повреждения позволяет определить максимальные различия в проницаемости во C. rodentium инфекции между мышью штаммов.
• Убедитесь, что неинфицированных мышей управления, также проверяются на целостность эпителия барьер.

3. Измерение бактериальной нагрузки в тканях C. rodentium-инфицированных мышей

1. Добавить 1 мл стерильной PBSм автоклавного металлическая бусина с круглым дном 2 мл центрифужные пробирки использованием асептических условиях. Индивидуальные тканей собраны от каждого животного будет размещена в отдельном труб PBS. Масса трубы перед добавлением ткани.
2. Удалить слепой кишки и толстой кишки с помощью мыши. Отделить слепой кишки из толстой кишки и вытолкнуть содержимое просвета с помощью пинцета. Добавить содержимое в трубе PBS. После разделения 0,5 разделам см от дистального отдела толстой кишки и слепой кишки на 10% формалина фиксации, разрезать оставшиеся толстой кишки и слепой кишки продольно и промыть стерильной PBS перед размещением ткани в пробирках.
3. Взвесьте PBS труб с тканью, а затем гомогенизации образцов с использованием шарика колотушкой в ​​течение 6 мин при 30 Гц.
4. Использование асептики, добавьте 180 мкл стерильной PBS на лунку в 96-луночный планшет. Добавить 20 мкл каждого усредненного образца в первой скважины в каждом ряду. Хорошо перемешайте и серийно разбавленных, добавляя 20 мкл из каждой предыдущей а для получения разведения от 10 ^-1 (сначала мыLL) до 10 ^-6. Пластинку по 10 мкл каждого разведения из каждого образца в трех экземплярах на площади пластины LB дно с сеткой. Выдержите в течение ночи при 37 ° C.
5. Граф колониеобразующих единиц (КОЕ), то средний 3 единицы, и записать разведение, при котором каждый образец учитываются. Умножьте среднюю КОЕ на 50, а 20 мкл оригинал 1 мл образца был использован, и на коэффициент разбавления, при которой образец считался в результате КОЕ / мл. И, наконец, разделить на вес ткани для определения КОЕ / г.

4. Гистологическая оценка и иммунофлюоресцентного окрашивания инфицированных тканей толстой кишки

1. Сбор ткани, как в пункте 3.2. Магазин тканей в формалине в течение ночи, затем вымыть с 70% этанола. Добавить в парафин тканей и сократить 5 мкм разделы для окрашивания. Пятно гематоксилином и эозином для гистологической оценки и перейти к следующие шаги для иммунофлуоресцентного окрашивания.
2. Для deparaffinize тканей до окрашивания, место скользит вбанку Коплин окрашивания и положить в 65 ° С водяной бане в течение 10 мин. Далее, место слайдов в ксилоле в течение четырех промывки 2 мин каждый. Слайды должны быть регидратации с двумя 5-ти минутах моет в 100% этанола, а затем один 5 минут мыть в каждом из следующих действий: 95% этанола, 75% этанола и дН ₂ 0. Эти моет должно быть сделано в вытяжном шкафу, чтобы избежать воздействия вредных паров.
3. Место слайдов в банке Коплин с предварительно нагретым цитрат натрия буфера, а затем поместите в пароход в течение 30 минут, затем дайте постоять 30 мин. Этот процесс разрушает белки поперечные связи образуются формалином фиксации получения потенциальных антигенных сайтах.
4. Промыть PBS азид в течение 5 минут, три раза. Сухие горки и знак область вокруг ткани с PAP пера создают гидрофобный барьер, сохраняя окрашивания реагентов локализован на ткани.
5. Блок ткани в течение 1 часа при комнатной температуре с блокирующим буфером (например, α-козьей сыворотки) в иммунной влажности камеры.
6. Развести чопорнойарных антител к желаемой концентрации антител использованием буфера разбавления. Вылейте блокирующий буфер и добавить 50-100 мкл первичных антител к тканям. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 часов.
7. Промыть PBS азид в течение 5 минут, три раза. Добавить 50-100 мкл вторичного антитела, разведенного в буфере разбавления антител к тканям и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Промыть дН ₂ O в течение 5 минут, три раза.
8. Высушить слайдов, добавить DAPI продлить Золотой монтажа средних и применять покровное. Просмотр слайдов под флуоресцентным микроскопом.

Примечания:

• PBS азид может быть заменен свежеприготовленный PBS в качестве альтернативы, чтобы избежать роста бактерий при стирке среды от шага 4 и далее.

Результаты

Во время стандартного эксперимента инфекции, мышей, инфицированных примерно 2,5 х 10 ⁸ КОЕ через желудочный зонд 100 мкл в течение ночи C. rodentium культуры. Заражение мышей C57BL / 6 с C. rodentium результаты скромны и переходные потери веса и диареи. Хотя редкое явление с C57BL / 6 мышей, живо...

Обсуждение

Citrobacter rodentium инфекции предоставляет ценную модель для изучения как инфекционные болезни и колитов у мышей. Эта уникальная модель позволяет для характеристики как хозяин ответы, а также патогенных свойств бактерий. Действия, описанные в этом протоколе подробно успешного использов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Лурия Бульон	ПРО	G247	Добавить 25 г порошка LB 1л воды. Автоклаве перед использованием.
Площадь нижней плиты с сеткой	Рыбак	08-757-11A
Сокол культуры трубы	Sarstedt	62.515.006
Лампа наконечником желудка через зонд иглы	Средства изобразительных наук	18060-20
1 мл шприца	BD Biosciences	309659
4 кДа FITC-декстрана	Сигма	FD-4
Лимонная кислота	Сигма	C7129
Цитрат натрия	Рыбак	S279-500
Декстроза	Рыбак	D16.1
Кислота цитрат декстрозы			20 мМ ctiric кислоты, 110 мМ цитрат натрия, 5 мМ декстрозы
Черные 96-луночный планшет	Рыбак	07-200-762
Металлические бусины (5 мм)	Qiagen	69989
10% формалине	Рыбак	5F93-4
5 мл флаконе	DiaMed	STK3205
Гематоксилин	Рыбак	H345-23
Эозин	Рыбак	E511-100
Ксилол	Рыбак	HC700-1GAL
Tween 20	Сигма	P5927
Коплин окрашивания банке	VWR	47751-792
Буфер цитрат натрия			10 мМ цитрат натрия, 0,05% твин-20, рН 6,0
Пап пера	Cedarlane	Mu22
Коза сыворотке	Сигма	G902-3
Бычьего сывороточного альбумина (БСА)	Рыбак	BP1600-100
Triton X-100	Сигма	T8532
Азид натрия	Сигма	SZ002
Блокировка буфера			2% козьей сыворотки, 1% BSA, 0,1% тритона X-100, 0,05% Твин-20, 0,05% натрияазид, 0,01 М PBS, рН 7,2, смешать и хранить при 4 ° C.
Буфер антител разбавления			0,1% тритона Х-100, 0,1% BSA, 0,05% азида натрия, 0,04% ЭДТА
Блокировка буфера и буфера для разведения антител для книжек			То же рецептам, что и выше, но без добавления моющих средств (тритон Х-100 и Твин 20)
Продлить Золотой реагентов Antifade с DAPI	Invitrogen	P-36931
Покровные	Рыбак	12.54SE
Настольная инкубационный шейкер	Barnstead Лаборатории линии	Макс Q4000
Флуорометр	Perkin Elmer	Victor2D
Центрифуга с охлаждением	Beckman Coulter	Микроцентрифуге 22R
Пароход	Черное & Decker
Флуоресцентный микроскоп	Zeiss	Axio Image.Z1