Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

Zusammenfassung

Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um ein robustes Modell von Infektionskrankheiten und Colitis zu produzieren, sowie die Methoden zur Citrobacter rodentium Infektion in Mäusen zu charakterisieren. C. rodentium ist ein gram-negative, murine bestimmte bakterielle Erreger, die eng mit der klinisch wichtige menschliche Krankheitserreger enteropathogenen E. verwandt ist coli und enterohämorrhagischen E. coli. Nach Infektion mit C. rodentium, immunkompetenten Mäusen leiden bescheiden und vorübergehende Gewichtsverlust und Durchfall. Histologisch sind Darm-crypt Dehnung, Immun-Zell-Infiltration und Becherzellen Zell-Depletion beobachtet. Clearance der Infektion wird nach 3 bis 4 Wochen erreicht. Messung der intestinalen Epithelbarriere Integrität, bakterielle Belastung und histologische Schäden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion, erlauben die Charakterisierung von Mausstämmen anfällig für Infektionen.

Die Virulenz Mechanismuss mit dem bakteriellen Erreger besiedeln den Darm ihrer Wirte sowie bestimmten Host Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen sind weitgehend unverstanden. Deshalb ist die C. rodentium Modell enterischen bakterielle Infektion dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Es wurde vermutet, dass die maladaptive chronischen Entzündungsreaktionen bei CED-Patienten gesehen, bei genetisch anfälligen Personen nach abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Darmbakterien zu entwickeln. Daher bietet die Studie von Modellen von infektiöse Kolitis erhebliches Potential zur Definition potentiell pathogenen Host Reaktionen auf Enterobakterien. C. rodentium induzierte Colitis ist eine solche seltenen Modell, das für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien ermöglicht,, das Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese;essentiell für die Entwicklung von neuartigen präventiven und therapeutischen Behandlungen.

Einleitung

Infektion durch enterale bakterielle Erreger löst gastrointestinale (GI) Entzündungen sowie Darm-Pathologie und Pathophysiologie, einschließlich Durchfall und Darm-epitheliale Barriere Dysfunktion. Die Virulenz Mechanismen, durch die bakteriellen Erreger besiedeln den GI-Trakt der Gastgeber, sowie spezielle Host-Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen schlecht verstanden werden, haben jedoch Fortschritte in der Modellierung von enterischen bakterielle Infektionen begonnen, unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Die IBDs Morbus Crohn (CD) und UC sind komplexe Erkrankungen unbekannter Ätiologie, die durch chronische Darm-Entzündung und Gewebeschädigung gekennzeichnet. Viele Mausmodellen Darmentzündung existieren, durch spontane Entzündung in genetisch modifizierten Stämme wie IL10 - / - Mäuse, um chemische Herausforderungen mit Verbindungen, wie Dextran Natriumsulfat (DSS) und dinitrobenzene sulfonsäure (DNBS) ^1. Es wurde vermutet, dass die Fehlanpassung chronischen Entzündungsreaktionen in IBD-Patienten bei genetisch vorbelasteten Individuen entwickeln bei einem abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Enterobakterien ^2, also in der Studie von Modellen von infektiöse Kolitis auch signifikante Möglichkeit der Festlegung von potentiell pathogenen Host . Reaktionen auf Enterobakterien Citrobacter rodentium induzierte Colitis ist eines der seltenen Modelle infektiöse Kolitis, aber gut ^1,3 dadurch, so dass für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien und weiteres Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese; ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung neuartiger präventiven und therapeutischen Behandlungen.

C. rodentium ist ein Anbringen und gramnegative Effacing (A / E), Murines spezifischen bakterielles Pathogen, das eng mit dem wichtigen menschlichen zusammenhängtPathogene enteropathogenen E. coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) ^3-8. Die Familie von A / E Pathogene innig an die apikale Wirtszellmembran der Blinddarm und Kolonepithel befestigen, Bilden einer nicht-invasiven sockelartigen Struktur auf der Wirtszelle. Oral Herausforderung mit C. rodentium von 10 ⁸ -10 ⁹ Organismen produziert eine robuste Ausführung der infektiöse Kolitis durch die mikrobielle Hyperplasie oder Dehnung der Krypten, einkernigen Immunzelle Infiltration und Becherzellen Zelldepletion ^3,4 charakterisiert. Der Ort der ersten Besiedlung, ein paar Stunden nach Herausforderung, an der Blinddarm Patch, gefolgt von Progression zu distalen Kolon 2 bis 3 Tage nach der Infektion ^3. Bei immunkompetenten Maus-Stämmen ist Clearance des Erregers 3 bis 4 Wochen nach der Infektion ^1,3,4 erreicht. Allerdings sind viele genetisch veränderte Stämme, zB Gen defizient oder Knockout-(- / -)-Mäusen wurden, gefunden worden, um anzuzeigen Increased Infektionsanfälligkeit was zu Schäden übertrieben und / oder chronischen Infektion und Entzündung ^9-14. Mit der Benutzung dieser infektiöse Kolitis Modell in dieser Knockout-Stämme, viele fehlen angeborenen Signalproteine, wurde bei der Aufdeckung mehrerer Wirtsproteinen integraler Bestandteil Auflösung von Darm-Infektion und Entzündung unverzichtbar.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Citrobacter rodentium Inokulum und orale Gabe von Mäusen

1. Vorbereiten und autoklavieren Luria Bertani Broth (LB).
2. Erhalten lebensfähigen C. rodentium aus einem gefrorenen Glycerin Lager und streifenfrei auf LB-Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Pipettenspitze. Bei 37 ° C über Nacht. Beimpfen 3 ml steriler LB Brühe in einen Falken Kultur Rohr mit Kolonien von der LB-Platte mit einer Impföse oder Pipettenspitze. Vorbereitung des Inokulums sollte mit aseptischen Techniken.
3. Inkubieren C. rodentium Kultur aerob bei 37 ° C über Nacht in einer Benchtop Inkubationsschüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute. Die beimpften LB-Brühe sollte erscheinen nach Übernacht-Kultur bewölkt.
4. Verwenden Sie eine Glühlampe gekippt Magen Magensonde Nadel an einer 1 ml Spritze, jede Maus mit 100 ul der Nacht C. Magensonde rodentium Kultur. Gently scruff der Maus an, indem Sie die lose Haut über seinen Nacken und Rückenmit Daumen und Fingern. Ziehen Sie den Kopf des Tieres mit dem Zeigefinger auf den Kopf fixieren und glätten die Speiseröhre zum Einsetzen der Sonde Nadel.
5. Aufrechterhaltung der Maus in einer aufrechten Position und die Glühbirne leiten Spitze der Nadel Magensonde entlang der Seite seiner Öffnung und über seine Zunge. Vorsichtig passieren die Nadel auf dem Dach des Mundes und fördern es durch die Speiseröhre. Wenn es irgendeinen Widerstand zu spüren während dieses Vorgangs, entfernen Sie die Sonde Nadel und legen Sie sie erneut.
6. Langsam spritzen 100 ul des bakteriellen Inokulums und entfernen Sie vorsichtig die Magensonde Nadel. Überwachen Sie die Atemfrequenz und das Verhalten der Maus nach Rückgabe an seinem Käfig.

Notes:

• In den Schritten 2 und 3, ferner einen falcon Kulturröhrchen unter aseptischen Bedingungen mit 3 ml sterile LB Brühe über Nacht kultiviert werden, um sicherzustellen, dass es keine bakterielle Verunreinigung der Brühe selber. Die LB-Brühe sollte erscheinen nach Übernacht-Kultur deutlich.
• vorsichtig geschwenkt die Kultur innerhalb des Falcon-Röhrchen vor dem Laden Spritzen für Magensonde so daß eine gleiche Dosis von Bakterien an jeder Maus geliefert wird, in Schritt 4.
• Übernacht-Kultur zu verwerfen, wenn sie für mehr als 24 Stunden geimpft werden.
• Alle C. rodentium Infektionen und Gehäuse von infizierten Tieren sollte in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden.

2. Mess Kolonepithelzellen Barrier Durchlässigkeit in C. rodentium-infizierte Mäuse

1. Messen Barriere Integrität bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion.
2. Am Tag des Assays, bereiten genug 4 kDa Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 80 mg ml ^-1 jede Maus mit 150 ul Magensonde und die Standard-Kurve zu erstellen.
3. Scruff die Maus und die Magensonde mit 150 ul FITC-Dextran. Zurückzuziehen Lebensmittel aus dem Käfig zu diesem Zeitpunkt.
4. Anesthetize Mäusen 4 h nachgavaging und sammeln Sie so viel Blut wie möglich (~ 450 ul) durch Herzpunktion. Fügen Sie das Blut bis zu einer Endkonzentration von 3% Säure-Citrat-Dextrose in einem Mikrozentrifugenröhrchen zur Gerinnung zu verhindern. Euthanize die Mäuse und sammeln Kolon Geweben in PBS für Keimzahlen (Schritte 3.1 - 3.5) und in 10% Formalin für Gewebefixierung und letztlich Immunfluoreszenzfärbung (Schritte 4,1 bis 4,8).
5. Drehen Sie die Blutproben bei 1.000 xg für 12 min in einer Zentrifuge bei 4 ° C. Das Serum und mit Wasser auf 1/10 und 1/100 in PBS. Je 100 ul jeder Probe an diesen beiden Verdünnungen in eine 96-Well-Platte in repliziert.
6. Um den Standard-Kurve zu erstellen, verdünnen das Original 80 mg ml ^-1 FITC-Dextran verwendet, um die Mäuse in PBS zu den folgenden Konzentrationen Magensonde: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 und 0 ug / ml . Fügen Sie 100 ul von jeder Konzentration auf eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung.
7. Quantifizierung der Fluoreszenz von jeder Probe unter Verwendung eines Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge wavelength von 485 nm und 535 nm Emissionswellenlänge.
8. Analysieren Sie die Rohdaten durch Auftragen der Standardkurve. Eingangs der Rohdaten für jede Probe in die Gleichung der Geraden durch die Standardkurve erzeugt werden, um die Konzentration von FITC-Dextran in jeder Probe zu bestimmen.

Notes:

• Vom Schritt 4 weiter, halten Blutproben auf Eis und Minimierung der Exposition gegenüber Licht.
• Beim Messen Epithelbarriere Integrität ein Zeitpunkt, bei, oder vor, beträgt 7 Tage nach der Infektion optimal, da schwere Gewebeschädigung beginnt, sobald dieser Stelle. Mess-Barriere Integrität vor schweren Schäden können Sie maximal Unterschiede in Durchlässigkeit während C. bestimmen rodentium Infektion zwischen Mausstämmen.
• Stellen Sie sicher, dass infizierte Kontrollmäuse sind auch für epitheliale Barriere Integrität getestet.

3. Messung der bakteriellen Belastung in Geweben von C. rodentium-infizierte Mäuse

1. 1 ml steriler PBS einnd ein autoklaviert Metallsicke zu einem runden Talsohle 2 ml Zentrifugenröhrchen unter aseptischen Bedingungen. Einzelnen Geweben von jedem Tier gesammelt werden, in separaten PBS Röhren platziert werden. Wiegen die Röhren vor der Zugabe des Gewebes.
2. Entfernen Sie den Blinddarm und Dickdarm von der Maus. Trennen Sie den Blinddarm aus dem Darm und verdrängen die luminalen Inhalte mit einer Pinzette. Fügen Sie den Inhalt in einen PBS Röhre. Nach der Trennung 0,5 cm große Stücke aus der distalen Dickdarm und Blinddarm für 10% Formalin-Fixierung, schnitt den restlichen Dickdarm und Blinddarm längs und waschen mit sterilem PBS, bevor Gewebe in Röhren.
3. Wiegen die PBS Röhrchen mit dem Gewebe und anschließend homogenisieren der Proben unter Verwendung einer Kugelmühle für 6 min bei 30 Hz liegt.
4. Unter aseptischen Bedingungen, fügen Sie 180 ul sterilem PBS pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 20 ul jeder homogenisierte Probe in die erste Vertiefung in jeder Zeile. Gut mischen und seriell verdünnen, Zugabe von 20 ul von jeder vorherigen gut Verdünnungen von 10 ^-1 erhalten (wir zuerstll) bis 10 ^-6. Plate 10 ul jeder Verdünnung von jeder Probe in dreifacher Ausfertigung auf einem quadratischen unteren LB-Platte mit einem Gitter. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
5. Graf Kolonie bildenden Einheiten (KBE), dann der Mittelwert der 3 zählt, und notieren Sie die Verdünnung, bei der jede Probe wurde gezählt. Multiplizieren durchschnittliche CFU von 50, wie 20 ul der ursprünglichen 1 ml Probe verwendet wurde, und durch den Verdünnungsfaktor, bei der die Probe gezählt resultierende in KBE / ml wurde. Schließlich teilen sich durch das Gewebe Gewicht KBE / g zu bestimmen.

4. Histologische Beurteilung und Immunfluoreszenzfärbung von Infected Colon Tissues

1. Collect Geweben, wie in Schritt 3.2. Shop Geweben in Formalin über Nacht, dann mit 70% Ethanol waschen. Einbetten Gewebe in Paraffin und schneiden 5 &mgr; m-Schnitte für die Färbung. Stain mit Hämatoxylin & Eosin für die histologische Beurteilung und fahren Sie mit den folgenden Schritten für Immunfluoreszenzfärbung.
2. Um Gewebe vor der Färbung Entparaffinieren, gleitet ineine Coplin Färbeküvette und legte in 65 ° C Wasserbad für 10 min. Weiter, Objektträger in Xylol für vier Wäschen jeweils 2 Min. 95% Ethanol, 75% Ethanol und dH ₂ 0: Objektträger dann mit zwei 5-minütigen Waschungen in 100% Ethanol, um einen 5 min Waschschritt in jedem der folgenden gefolgt rehydratisiert werden. Diese Wäschen sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um die Exposition gegenüber schädlichen Dämpfen zu vermeiden.
3. Objektträger in die Coplin mit vorgewärmter Natriumcitratpuffer und anschließend in einen Dampfer für 30 min, dann lassen Sie sich für 30 min. Dieser Prozess bricht die Protein-Vernetzungen durch Formalinfixierung Wiedergewinnen potentielle antigene Stellen gebildet.
4. Waschen mit PBS für 5 min Azid, dreimal. Dry Dias und mark Umgebung Gewebe mit einem PAP Stift eine hydrophobe Barriere zu schaffen, halten die Färbereagenzien auf das Gewebe lokalisiert.
5. Block Gewebe für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Blocking-Puffer (z. B. α-Ziegenserum) in einer feuchten Kammer Immunfärbung.
6. Verdünnen primary Antikörper gewünschten Konzentration mit Antikörperverdünnungspuffer. Abgießen Blocking-Puffer und fügen 50-100 ul des primären Antikörpers an Geweben. Inkubieren bei 4 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
7. Waschen mit PBS für 5 min Azid, dreimal. Hinzufügen von 50 bis 100 ul sekundären Antikörper in Verdünnungspuffer Antikörpers an das Gewebe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln verdünnt. Waschen mit dH ₂ O für 5 Min., dreimal.
8. Entwässern Folien, fügen DAPI verlängern Gold-Eindeckmedium und Deckglas. Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Notes:

• PBS-Azid kann mit frisch zubereiteten PBS als Alternative zu bakteriellen Wachstums in dem Waschmedium aus Schritt 4 weiter substituiert sein vermeiden.

Ergebnisse

Während einer Standard-Infektion Experiment werden Mäuse mit ca. 2,5 x 10 ⁸ CFU durch eine Magensonde von 100 ul Nacht C. infiziert rodentium Kultur. Infektion von C57BL / 6 Mäusen mit C. rodentium Ergebnisse in bescheidenen und vorübergehenden Gewichtsverlust und Durchfall. Obwohl ein seltenes Ereignis mit C57BL / 6 Mäusen, können die Tiere krank werden und erfordern Euthanasie. Daher sollten Mäusen Grad der Gewichtsverlust und Symptome von Stress, wie piloerect Fell und gek...

Diskussion

Citrobacter rodentium Infektion stellt ein geeignetes Modell für die Untersuchung von sowohl infektiösen Krankheit und Colitis bei Mäusen. Diese einzigartige Modell erlaubt die Charakterisierung von Host Reaktionen sowie der pathogenen Eigenschaften der Bakterien. Die beschriebenen Schritte in diesem Protokoll detailliert die erfolgreiche Anwendung dieses Modells.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll im Auge zu behalten, wenn induzieren ulcerosa und Analyse Antwo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Catalog Number	Kommentare
Luria Broth	ABM	G247	Fügen Sie 25 g LB Pulver 1L Wasser. Autoklavieren vor dem Gebrauch.
Platz Bodenplatte mit Gitter	Fischer	08-757-11A
Falcon Kulturröhrchen	Sarstedt	62.515.006
Bulb gekippt Magen Magensonde Nadel	Fine Science Tools	18060-20
1 ml Spritze	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-Dextran	Sigma	FD-4
Zitronensäure	Sigma	C7129
Natriumcitrat	Fischer	S279-500
Traubenzucker	Fischer	D16.1
Saurem Citrat Dextrose			20 mM ctiric Säure, 110 mM Natriumcitrat, 5 mM Dextrose
Schwarze 96-Well-Platte	Fischer	07-200-762
Metallperlen (5 mm)	Qiagen	69989
10% Formalin	Fischer	5F93-4
5 ml Flasche	DiaMed	STK3205
Hematoxylin	Fischer	H345-23
Eosin	Fischer	E511-100
Xylol	Fischer	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Coplin Färbeküvette	VWR	47751-792
Natriumcitratpuffer			10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0
Pap pen	Cedarlane	Mu22
Ziegenserum	Sigma	G902-3
Rinderserumalbumin (BSA)	Fischer	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Natriumazid	Sigma	SZ002
Blocking-Puffer			2% Ziegenserum, 1% BSA, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% NatriumazidAzid, 0,01 M PBS, pH 7,2, Mix & Standort bei 4 ° C.
Antikörperverdünnungspuffer			0,1% Triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% Natriumazid, 0,04% EDTA
Blockpuffer & Antikörper Verdünnungspuffer für tir			Gleichen Rezepte wie oben, jedoch ohne Zusatz von Reinigungsmitteln (Triton X-100 und Tween 20)
Verlängern Gold-Antifade Reagenz mit DAPI	Invitrogen	P-36.931
Deckgläser	Fischer	12.54SE
Benchtop Inkubationsschüttler	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorometer	Perkin Elmer	Victor2D
Kühlzentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Dampfer	Black & Decker
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axio Image.Z1