评估抗小鼠动脉功能使用压力Myography

摘要

在压力myography，一艘船一个完整的小部分安装到两个小插管，加压到一个合适的管腔压力。在这里，我们描述的方法来衡量鼠标3的血管舒张反应 ^{RD 1 - / -}小鼠使用压力myography。

摘要

压力肌动描记系统是精美实用的小动脉功能评估，加压到一个合适的透压力。接近生理条件实现压力myography的允许深入刻画的内在反应的药理和生理刺激，可以外推到在体内行为的血管床。压力肌动描记有几个优点，比传统的线myographs。例如，较小的阻力血管，可以研究在严格控制和生理相关的腔内压力。在这里，我们学习^三阶肠系膜动脉（长3-4毫米），预先使用新福林，血管放松对乙酰胆碱的反应能力。肠系膜动脉插管连接到加压和密封系统，保持在恒定的压力为60毫米汞柱的安装。容器的内腔和外直径是后续的狡黠的记录，可使用视频摄像头，允许实时定量去氧肾上腺素和乙酰胆碱的血管收缩和血管舒张，。

为了演示的适用性的压力myography研究心血管疾病的病因学，我们评估了在小鼠模型的全身性高血压的内皮依赖性的血管功能。高血压缺陷小鼠可溶性鸟苷酸环化酶_（sGCα1 ^{- / - ）}的α亚基上129S6（S6）的背景_（sGCα1 ^-/-S6），但不是当上C57BL / 6（B6）背景（sGCα ₁ ^-/-B6）。使用压力myography，我们证明了_sGCα1缺乏业绩受损的内皮依赖性血管舒张。血管功能障碍更加明显在_sGCα1 ^-/-S6比^_1sGCα-/-B6小鼠，可能贡献的纳克较高的血压比_sGCα1 ^-/-B6小鼠在_sGCα1 ^-/-S6。

压力myography是一个比较简单，但敏感机制有用的技术，可用于评估各种刺激血管的收缩和舒张的效果，从而增强我们深入了解心血管疾病的机制。

引言

压力肌动描记系统用来测量小动脉，静脉和其他血管的生理功能和属性。动脉或静脉的一个完整的小部分被安装到两个小玻璃插管，加压至一个合适的腔的压力，使容器保持其大部分在体内的特征（ 图1和2）。在压力肌动描记接近生理条件反映了体内的血管床的行为，允许调查孤立船只的内在属性（ 如生肌音）。压力myography超过的线myography，肌肉收缩的评估是通过直接的机械耦合的力换能器¹的一些优点，包括（i）微动脉阻力，它定义了在血管系统的整体电阻，可以研究，而丝肌动描记限于较大的动脉导管，（ⅱ）吨帽子来损伤血管内皮细胞的风险被降低了，因为没有电线需要通过血管腔，（ⅲ），更好地保持该船只的自然形状，及（iv）可以在范围广泛的研究，容器尺寸压力或剪切力^2。

研究微船舶可以比学习更大的动脉导管，以帮助了解病理生理学和分子机制，有助于心血管疾病如高血压血管张力改变更多的信息。例如，8周高脂肪的饮食喂养小鼠血管内皮功能相关的减值可以证明在^第二阶肠系膜动脉，但不是在主动脉环（ 图3）。压力myography的另一个优点是，内在生肌收缩的压力容器是否存在，并可以研究，在这种现象中的血管内皮细胞的作用和功能。在这里，我们DESCRIBE使用压力肌动描记小鼠肠系膜^三阶阻力动脉血管反应性研究中设置的障碍一氧化氮（NO）-cGMP信号。

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研究方案

1。溶液的制备

1. 500X EDTA股票：称取500毫克EDTA钠_{2·2H 2} O，溶于50毫升去离子水。在室温下保存。
2. 氯化钾去极化的解决方案。
   1. 准备K10X原液：3.69克氯化钠，氯化钾，18.64克0.36克_硫酸镁无水，0.41克KH ₂ PO _4，0.46克CaCl _{2·2H 2} O溶解在250毫升的去离子水。在室温下保存。
   2. 对于100毫升最终的氯化钾溶液1X去极化：将0.21的NaHCO _3，0.18克葡萄糖90毫升去离子水溶解。加入10毫升的K10X股票溶液。 500X EDTA溶液中加入95μl。拌匀。贮存于4℃一周内使用。
3. 准备新鲜HEPES-PSS解决方案在当天的实验（1升）。
   1. 6.96克氯化钠，氯化钾，0.35克0.288克硫酸镁_{4·7H 2} O，0.1605克KH ₂ PO _4，2.38克HEPES。溶解在100毫升去离子水中。标记为烧瓶A.
   2. 0.312克氯化钙_{2·2H 2} O溶解在100毫升的去离子水。标记为B瓶中。
   3. 1.25克的NaHCO _3，葡萄糖0.991克。溶于98毫升去离子水。标记为烧瓶C.
4. 添加2毫升500X EDTA烧瓶C.在一个大瓶700毫升去离子水。连续的震荡的大瓶中，倒入烧瓶A，B和C的内容。用NaOH将pH调节至7.4。

2。使用的药物

1. 去氧肾上腺素（10 ^-2 M）：20.37毫克溶于10毫升去离子水。分装1毫升和储存在-80°C。串行稀释，得到10 ^{-3，10 -4，10 -5，10 -6} mol / L的天实验。
2. 乙酰胆碱（10 ^-2 M）：18.17毫克溶于10毫升去离子水。分装1毫升和储存在-80°C。串行稀释，得到10 ^{-3，10 -4，10 -5，10 -6}mol / L的天实验。

3。小鼠

整个研究研究男WT和_sGCα1 ^{- / -}小鼠对S6和B6背景。 _sGCα1 ^{- / -}产生如前面所述^4,5。住房和程序，涉及实验动物（小鼠），马萨诸塞州的波士顿马萨诸塞州总医院的研究动物护理小组委员会批准。

4。肠系膜动脉血管反应性测量

1. 安乐死小鼠戊巴比妥钠（200毫克/千克，IP）。打开腹腔及肠系膜组织解剖。隔离和^三阶免费的结缔组织和脂肪组织的解剖肠系膜上动脉，动脉放置在冰冷的HEPES-PSS解决方案预平衡95％O _{2/5％CO 2}为15分钟。切2-3毫米长，没有从肠系膜分支环大动脉。时，有没有血液在血管的动脉和静脉之间微血管水平的差异是有问题的。因此，我们建议识别船只，而它在动物解剖出来之前，仍然完好无损。
2. 填写在HEPES-PSS溶液与10毫升注射器的帮助下，通过入口阀和出口阀的肌动描记器的压力腔室（DMT型号110P 11P版本1.31， 图2）与在玻璃插管。应该做填充套管轻轻地，仔细，因为压力过大可能会损坏脆弱的传感器连接到套管。灌装后插管进，出口阀门紧紧关闭。
3. 船只到右套管的一端安装，并仔细配合它与尼龙缝合线的细线之一。借助注射器，冲洗，并填写在血管与的HEPES解决方案通过进气阀。在左侧的套管带来接近容器，容器的另一端安装到其上。把它绑尼龙缝合。填室HEPES溶液10毫升。 HEPES轻轻推解决方案的帮助下，用注射器通过进气阀泄漏检查。
4. 安装室肌动描记下的视频摄像头。室开始的氧气和热量（37℃）。 HEPES溶液容器从第一管P1的入口阀连接，而在该阀关闭。让管任何气泡和解决方案，通过在管内，直到没有气泡。打开阀门。
5. 将左侧室管P2来自压力调节阀。再次检查任何气泡。不应该有任何气泡或在整个系统中的泄漏。
6. 压力菜单上肌接口的面板或在软件中打开泵，同时关闭流。
7. 打开程序，然后点击索取。船舶应出现在屏幕上（ 图3）。该容器是可视化用照相机装在显微镜，允许monitoring和分析血管腔，血管直径和壁厚。
8. 肌接口面板或程序选择P1压力逐步提高的interluminal通过P1阀的压力和输入的压力值如下5毫米汞柱→10→20→40→60毫米汞柱。船只的某个时候容易扭曲或卷积的压力增加时，调整张力或垂直或纵向微定位（ 图2）的帮助下，与相 ​​应的应变。平衡的容器中，在60毫米汞柱和37℃下至少45分钟。更换槽液一次预热的HEPES在平衡。
9. 应用10毫升的KCl去极化溶液，在37℃下预热，浴完全去极化平滑肌细胞和达到最大收缩。收缩稳定后，冲洗HEPES溶液3次，每次10分钟洗澡。
10. 稳定与生殖血管的内皮细胞的完整性检查的可行性此外去氧肾上腺素（10 ^-5 M）和乙酰胆碱的IBLE反应（10 ^-5 M）。冲洗3次，用HEPES溶液每10分钟。
11. 添加脱羟肾上腺素（10 ^-5 M）以preconstrict容器，并且得到稳定的收缩时，执行的累积浓度-的血管舒张响应曲线（CRC）顺序加入增加剂量的乙酰胆碱（10 ^-9 3×10 ^{- 9，10 -8} 3×10 ^{-8，10 -7} 3×10 ^{-7，10 -6} 3×10 ^{-6，10 -5 M）。}最后一剂后，HEPES溶液冲洗3次，每10分钟才开始新的CRC。
12. 应用的Ca ^{2 +} PSS的含有2mM EGTA确定被动管腔的直径。从所记录的描记测量管腔直径为每个剂量响应（ 图4），这将被用于计算的所有参数。
13. PERC表达所有的乙酰胆碱的舒张反应entage管腔直径去氧肾上腺素preconstriction后的变化相比，苯肾上腺素收缩后的直径无钙和直径之间的差异，使用下面的公式：
14. 扩百分率= 100％×[（深_x - _{D i}的）/（D _钙自由 - _{D i}的）]，其中D是测量的管腔直径和X，I，和无钙激动剂在每个剂量表示动脉直径（x）的初始直径以下福林收缩部（ⅰ），和的Ca ^{2 +}的缓冲液（无钙）。

5。统计分析

所有连续测量平均值±SEM表示。肠系膜动脉血管反应性重复测量双向方差分析。在所有情况下，P <0.05被认为是统计学意义。

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结果

NO的中心参与血压体内平衡维持在^6，在动物模型中⁷人类。控制血管平滑肌松弛的能力NO介导的可溶性鸟苷酸环化酶（SGC），含血红素的异二聚体酶生成cGMP的^8。最近，血压修改遗传变异被确定轨迹包含_sGCα1和_1sGCβ基因，说明在人类⁹调节血压相关的SGC。有趣的是，雄性小鼠缺乏_SGC（sGCα1 ^{- / - ）}的α亚基上129S6（S6）的背景_（sGCα1

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讨论

老鼠是许多研究者的实验模型的选择，部分是因为引进遗传修饰小鼠模型，从而产生人类生理的可能性。作用于血管的阻力小的状态，但并不代表较大的导管容器主要确定了整个血管系统¹¹的血流量的调节。动脉阻力的大小，在小动物，如小鼠，可防止使用钢丝肌动描记研究微血管功能。压力myographs不仅克服这个限制，但也允许在接近生理条件下，血管功能的测量。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT