圧力筋運動記録法を用いたマウス抵抗動脈機能を評価

要約

圧力筋運動記録法では、容器の無傷の小セグメントは、2つの小さなカニューレに取り付けられて、適切な内腔の圧力に加圧した。ここでは、マウス3の血管弛緩応答を測定する方法を説明 ^{RDオーダー腸間膜動脈 _{1 - / -}}圧力筋運動記録法を用いたマウス。

要約

圧力ミオグラフシステムは、適切な経壁圧に加小動脈の機能評価、で絶妙に便利です。圧力筋運動記録法で達成近い生理状態は血管床の生体内挙動に外挿することができる薬理学的および生理学的な刺激に固有の応答の詳細な特性評価を可能にします。圧力ミオグラフは、従来のワイヤmyographsに比べていくつかの利点を有する。例えば、小さい抵抗容器はしっかりと制御され、生理学的に適切な管腔内の圧力で研究することができる。ここでは、アセチルコリンに反応して血管リラックスするフェニレフリンで前収縮させた^3次腸間膜動脈（長い3〜4ミリメートル）、、の能力を研究しています。腸間膜動脈を60 mmHgで一定の圧力に維持される加圧されてシールされたシステムに接続された2つのカニューレに取り付けられている。脈管の内腔と外径がcontinuouあるずるそうはそれぞれ、フェニレフリンおよびアセチルコリンに反応して血管収縮と血管弛緩のリアルタイム定量化を可能にし、ビデオカメラを用いて記録した。

心血管疾患の病因を研究するために、圧力筋運動記録法の適用可能性を実証するため、我々は、全身性高血圧症のマウスモデルにおける内皮依存性血管機能を評価した。可溶性グアニル酸シクラーゼ（ ^{- / -} _sGCα1）の_α1サブユニット欠損マウスは時129S6（S6）背景_（sGCα1 ^-/-S6）に高血圧ですが、ないときはC57BL / 6（B6）背景（sGCαに₁ ^-/-B6）。圧力筋運動記録法を用いて、障害内皮依存性血管弛緩における_sGCα1欠乏の結果のことを示しています。血管の機能不全は、おそらく_{contributisGCα1} ^-/-B6マウスより_sGCα1 ^-/-S6においてより顕著である_sGCα1 ^-/-B6マウスより_sGCα1 ^-/-S6が高い血圧にNG。

圧力筋運動記録法により、心血管疾患のメカニズムに私達の洞察力を増強、血管の収縮と弛緩に様々な刺激の効果を評価するために使用することができ、比較的簡単ですが、高感度かつ機構的に有用な技術である。

概要

圧力ミオグラフシステムは小動脈、静脈及び他の血管の生理学的機能および特性を測定するために使用される。動脈または静脈の無傷の小セグメントは、2つの小さなガラスカニューレに取り付けられ、槽がインビボ特性（ 図1および2）のの大部分を維持することができ、適切な内腔の圧力に加圧される。圧力ミオグラフにおける生理学的状態の近くに孤立血管の本質的な性質（ 例えば筋トーン）の調査を可能にする、血管床の生体内挙動に反映されます。筋収縮力変換装置¹への直接の機械的結合によって評価されるワイヤ筋運動記録法、過圧力筋運動記録法の利点のいくつかは、血管系で開発された全体の抵抗を定義するマイクロ抵抗動脈が、一方で、検討することができる（i）を含むワイヤーミオグラフは大きい導管動脈、（ⅱ）Tに限定されているまだワイヤが（iii）の容器の自然な形状が良好に維持される、血管内腔を通過する必要がないので、内皮細胞に損傷を与えるハット危険性が低減され、および（iv）した船舶寸法は、広範囲ので学ぶことができる圧力やせん断応力^2。

微細血管を勉強することは、高血圧などの心血管疾患で、変更された血管緊張に貢献病態と分子メカニズムを理解するために大規模な導管動脈の勉強よりも有益なことができます。例えば、8週間のマウスに高脂肪食を供給するに関連付けられている血管内皮機能障害はなく、大動脈輪で2 ^回オーダー腸間膜動脈を^3（ 図3）で実証することができます。圧力筋運動記録法の別の利点は、加圧容器の固有筋収縮が存在することであり、この現象内皮の役割と機能について検討することができる。ここでは、DESCR損なわれた一酸化窒素（NO）-cGMPのシグナリングの設定でマウスの腸間膜^3次抵抗動脈の血管反応性を研究するために、圧力ミオグラフの使用をIBE。

プロトコル

1。溶液の調製

1. 500X EDTAストック：500mgのEDTA- _の Na _{2•2H 2} Oを比較検討し、50ミリリットルの脱イオン水に溶解する。室温で保管してください。
2. 塩化カリウムは、ソリューションを脱分極。
   1. 3.69グラムのNaCl、18.64グラムのKCl、0.36グラム_硫酸マグネシウム無水、0.41グラムのKH ₂ PO _4、0.46グラムのCaCl _{2•2H 2} O：K10Xストック溶液を調製250ミリリットルの脱イオン水に溶解する。室温で保管してください。
   2. ソリューション1Xを脱分極100ミリリットル最終のKClの場合：90ミリリットル脱イオン水0.21のNaHCO _3、0.18グラムのブドウ糖を溶かす。 K10X原液10mlのを追加します。 500X EDTA溶液95μLを加える。よく混ぜる。 4℃で保存一週間以内にご使用ください。
3. 実験の日（1リットル用）に新鮮なHEPES-PSS溶液を調製。
   1. 6.96グラムのNaCl、0.35グラムのKCl、0.288グラム_{し、MgSO 4·7H 2} O•、0.1605グラムKH ₂ PO _4、2.38グラムHEPES。 100mlに溶解する脱イオン水。フラスコAとマーク
   2. 0.312グラムのCaCl _{2•2H 2} O脱イオン水100mlに溶解する。フラスコBとしてマーク
   3. 1.25グラムのNaHCO _3、0.991グラムのブドウ糖。 98ミリリットルの脱イオン水に溶解する。フラスコC.としてマーク
4. C.大きなフラスコ内の700ミリリットルの脱イオン水を取るフラスコ中500X EDTA 2 mlを加え。連続ボルテックス大きなフラスコにフラスコA、BおよびCの内容を注ぐ。 NaOHでpHを7.4に調整する。

2。使用される薬剤

1. フェニレフリン（10 ^-2 M）：10ミリリットルの脱イオン水に20.37ミリグラム溶かす。 -80アリコート1ミリリットルと店舗℃の直列実験の日に、10 ^{-3、10 -4、10 -5〜10 -6}モル/ Lを得るために希釈する。
2. アセチルコリン（10 ^-2 M）：10ミリリットルの脱イオン水に18.17ミリグラム溶かす。 -80アリコート1ミリリットルと店舗℃のシリアル10 ^{-3、10 -4、10 -5}及び10 ^-6を得るために希釈する実験当日のモル/ L。

3。マウス

男性WTと_sGCα1 ^{- / -} S6とB6の背景にマウスがこの研究を通して検討した。 _sGCα1 ^{- / -は4,5}前述のように作製した。実験動物（マウス）を含むハウジングと手順はマサチューセッツ総合病院、ボストン、マサチューセッツ州の研究動物のケアに小委員会によって承認された。

4。腸間膜動脈における血管反応性の測定

1. （200 mg / kg体重、腹腔内）ペントバルビタールでマウスを安楽死させる。腹腔を開き、腸間膜組織を解剖する。分離し、解剖結合および脂肪組織の自由^3次の腸間膜動脈、および95％O _2/15分間、5％CO ₂で予め平衡化し、氷冷HEPES-PSS溶液中の動脈を置く。無腸間から分岐して2〜3ミリメートルの長さのリングをカット動脈。血管内に血液が存在しない場合ミクロ血管レベルで動脈と静脈を区別することは問題である。したがって、我々はそれを解剖前に動物でまだそのままである一方、血管を識別をお勧めします。
2. 入口および出口弁を通しての10ml注射器の助けを借りて、HEPES-PSS溶液を用いて圧力ミオグラフ室（DMTモデル110P＆11Pバージョン1.31、 図2）におけるガラスカニューレに記入します。過度の圧力がカニューレに接続されている脆弱なトランスデューサーを破損する恐れがあるので、カニューレの充填を穏やかにし、慎重に行う必要があります。充填後カニューレはしっかり入口と出口バルブの両方を閉じます。
3. 右カニューレに容器の一方の端を取り付け、慎重にナイロン縫合糸の一つ細かい鎖とそれを結ぶ。注射器の助けを借りて、入口弁経由HEPES溶液を容器にフラッシュと記入。近い容器に左のカニューレに持参し、その上に容器のもう一方の端をマウントします。ナイロン縫合糸でそれを結ぶ。埋めるHEPES溶液で10ミリリットルまでとチャンバー。優しく注射器の助けを借りて、入口弁を介しHEPES溶液を押すことで漏れをチェックします。
4. ミオグラフで、ビデオカメラの下でチャンバーをインストールします。チャンバー内の酸素や熱（37℃）を起動します。バルブが閉じている間、第HEPES液リザーバからチューブP1と入口弁を接続する。チューブ内に気泡がなくなるまで、チューブを介して任意のバブルとソリューションパスしましょう​​。バルブを開きます。
5. チューブP2は圧力調整器から来るとチャンバーの左バルブを接続します。任意の気泡を再度確認してください。全体のシステム内の任意の気泡や漏れがあってはいけません。
6. ミオインターフェイスパネル上またはソフトウェア内の圧力メニューに移動し、流れをOFFしながらポンプをONにしてください。
7. プログラムを開いて、COLLECTをクリックします。容器（ 図3）現在画面に表示されるべきである。容器はmonitoriを可能にする、顕微鏡に取り付けられたカメラで可視化されるngのと血管腔、血管径、肉厚の分析。
8. 徐々にミオ - インターフェイスパネルまたはプログラムのP1の圧力を選択することにより、P1バルブ経由interluminal圧力を高め、次のように圧力値を入力します。5 mmHgの→10→20→40→60 mmHgの。容器はいつか圧力が増加している間にねじったり畳み込むする傾向;テンションを調整したり、垂直または縦マイクロポジショナー（ 図2）の助けを借りて、それに応じて負担。 60 mmHgので容器を平衡化し、37℃45分間、少なくとも。平衡時に予め温めHEPESで一度浴溶液を変更します。
9. のKCl脱分極溶液10mlを適用し、完全に平滑筋細胞を脱分極および最大収縮を達成するために浴に、37℃で温め。安定したくびれた後、HEPES溶液3回、10分ごとにバスをすすいでください。
10. 安定して再現することにより内皮の血管と整合性の実行可能性を確認してくださいフェニレフリンの添加（10 ^-5 M）およびアセチルコリンへ撓応答（10 ^-5 M）。 HEPES溶液ごとに10分で3回すすいでください。
11. ^-容器preconstrict、安定したくびれが得られた場合に、アセチルコリンの増加する用量（10 ^-9、3×10の逐次添加によって累積濃度血管拡張応答曲線（CRC）を実行するフェニレフリン（10 ^-5 M）を追加^{9、10 -8、3×10 -8、10 -7、3×10 -7、10 -6、3×10 -6}および10 ^-5 M）。最終投与後、10分ごとに新しいCRCを開始する前にHEPES溶液で3回すすいでください。
12. 2mMのEGTAを含むCa ^{2 +}のフリーPSSを適用することにより、受動的な内腔の直径を決定します。すべてのパラメータを計算するために使用される各用量反応のための記録されたトレーシング対策ルーメン径（ 図4）から。
13. PERCとしてすべてのアセチルコリン弛緩応答を表現以下の式を用いてフェニレフリン収縮後のカルシウムフリー直径と直径、の違いと比べてフェニレフリンpreconstriction後の内腔直径entageの変更：
14. パーセンテージ拡張= 100％X [（D _X - D _{I）/（Dカルシウムフリー} - D _I）]、ここで、Dは測定された内腔直径およびXは、私であり、CA送料アゴニストの各用量で動脈の直径を表す（x）は、初期の直径以下はくびれは、（i）、およびCa ^{2 +}を含まないバッファ（CA-無料）フェニレフリン。

5。統計分析

すべての連続測定は、平均±SEMとして表される。腸間膜動脈の血管反応性を反復測定の双方向分散分析によって分析される。すべての場合において、P <0.05は統計的に有意であると考えられる。

結果

NOは集中人間⁶および動物モデル⁷の両方で血圧の恒常性の維持に関与していません。血管平滑筋の弛緩を制御するNOの能力は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（sGCの）、cGMPの^8を生成ヘム含有ヘテロ酵素によって媒介される。近年、血圧修飾遺伝的変異は、ヒト⁹の血圧を調節するのsGCの関連性を示す_、sGCα1および_sGCβ1遺伝子を含む遺伝子座の同定...

ディスカッション

マウスは一部であるため、それによって人間の病態生理のためのマウスモデルを生成する遺伝子改変を導入する可能性があるため、多くの研究者のための選択の実験モデルである。血管小さい抵抗の状態ではなく、より大きな導管血管のは、主に脈管系¹¹を通して血流の調節を画定する。マウスのような小動物の抵抗動脈、のサイズが微小血管の機能を研究するためのワイヤミオグラ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT