Beurteilung Murine Widerstand Artery Funktion Mit Druck Myographie

Zusammenfassung

In Druck Myographie, wird ein intaktes kleines Segment von einem Schiff auf zwei kleine Kanülen angebracht und unter Druck gesetzt, um eine geeignete luminalen Druck. Hier beschreiben wir die Methode Vasorelaxation Reaktion der Maus 3 messen ^Rd Bestellen Mesenterialarterien in c57 und sGCα _{1 - / - Mäuse mit Druck Myographie.}

Zusammenfassung

Druck Myographions Systeme sind exquisit in der funktionalen Bewertung der kleinen Arterien nützlich, Druck auf einen geeigneten transmuralen Druck. Die nahe physiologischen Zustand in Druck Myographie erreicht ermöglicht eingehende Charakterisierung der intrinsischen Antworten auf pharmakologische und physiologische Reize, die auf die in vivo-Verhalten des vaskulären Bett extrapoliert werden kann. Druck Myographions hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Draht Myogrammgeräte. Zum Beispiel kann bei kleineren Widerstandsgefäße streng kontrolliert und physiologisch relevanten intraluminalen Druck untersucht. Hier untersuchen wir die Fähigkeit der ^3. Ordnung Mesenterialarterien (3-4 mm lang), preconstricted mit Phenylephrin, in Reaktion auf Acetylcholin Vaso-entspannen. Mesenterialarterien auf zwei Kanülen mit einem unter Druck stehenden und abgedichteten System, das bei einem konstanten Druck von 60 mmHg gehalten gelagert ist. Das Lumen und dem äußeren Durchmesser des Behälters sind continuously aufgezeichnet mit einer Videokamera, so dass Echtzeit-Quantifizierung der Gefäßverengung und Vasorelaxation in Reaktion auf Phenylephrin und Acetylcholin, beziehungsweise.

Um die Anwendbarkeit der Druck Myographie die Ätiologie der Herz-Kreislauf-Krankheit zu studieren demonstrieren beurteilten wir Endothel-abhängige Gefäßfunktion in einem Mausmodell der systemischen Hypertonie. Defizienten Mäusen in der α _{1-Untereinheit} der löslichen Guanylatzyklase (sGCα ₁ ^{- / -)} sind Hypertonie, wenn auf einem 129S6 (S6) Hintergrund ₍₁ sGCα ^-/-S6) aber nicht, wenn auf einer C57BL / 6 (B6) Hintergrund (sGCα ₁ ^-/-B6). Mit Druck Myographie zeigen wir, dass sGCα _1-Mangel führt zu einer Beeinträchtigung der Endothel-abhängige Vasorelaxation. Die vaskuläre Dysfunktion ist ausgeprägter in sGCα ₁ ^-/-S6 als in sGCα ₁ ^-/-B6 Mäuse, wahrscheinlich contributing des höheren Blutdruck in sGCα ₁ ^-/-S6 als in sGCα ₁ ^-/-B6 Mäusen.

Druck Myographie ist eine relativ einfache, aber sensibel und mechanistisch nützliche Technik, die verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Stimuli auf die vaskuläre Kontraktion und Entspannung zu bewerten, Damit ergänzen wir unsere Einblicke in die Mechanismen zugrunde liegenden kardiovaskulären Erkrankung werden kann.

Einleitung

Druck Myographions werden verwendet, um die physiologische Funktion und Eigenschaften der kleinen Arterien, Venen und anderen Fahrzeugen zu messen. Ein intaktes kleines Segment von einer Arterie oder Vene wird auf zwei kleinen Glas Kanülen angebracht und unter Druck gesetzt, um eine geeignete luminalen Druck, so dass das Schiff, die meisten seiner in vivo Eigenschaften (Abbildungen 1 und 2) zu erhalten. Die nahe physiologischen Zustand in einem Druck Myographions spiegelt die in vivo-Verhalten des vaskulären Bett, so dass die Untersuchung der intrinsischen Eigenschaften (zB myogenic Ton) von isolierten Gefäßen. Einige der Vorteile von Druck Myographie über Draht Myographie, wo Muskelkontraktion durch direkte mechanische Kopplung mit einem Kraftaufnehmer ¹ bewertet wird, (i) dass Mikro Widerstand Arterien, die den gesamten Widerstand in Gefäßsystem entwickelt definieren, können untersucht werden, während Draht Myographions sind größere Leitung Arterien, (ii) t begrenztHut das Risiko für das Endothel beschädigt wird reduziert, da keine Kabel durch die Gefäßlumen weitergegeben werden, (iii) dass die natürliche Form des Gefäßes wird besser gepflegt brauchen, und (iv) dass Schiffes Dimension kann in einem weiten Bereich von studiert werden Drücke oder Schubspannung ^2.

Studieren Mikrogefäßen kann informativer sein als das Studium größeren Leitung Arterien zu helfen, die Pathophysiologie und molekularen Mechanismen, die zu einer veränderten Gefäßtonus in Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck beitragen. Zum Beispiel könnte Beeinträchtigung der Endothelfunktion bei der Fütterung Mäusen eine fettreiche Diät für 8 Wochen verbunden in der ^2. Ordnung Mesenterialarterien ^3, aber nicht in Aortenringe (Abbildung 3) nachgewiesen werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass Druck Myographie intrinsische myogenic Verengung des Druckbehälters vorhanden ist, und dass die Rolle und die Funktion des Endothels bei diesem Phänomen kann untersucht werden. Hier DESCR wirIbe die Verwendung eines Druck Myographions vaskuläre Reaktivität Maus mesenterica ^3. Ordnung Widerstand Arterien in einer Umgebung von beeinträchtigter Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalisierung zu studieren.

Protokoll

1. Herstellung der Lösung

1. 500X EDTA Lager: wiegen 500 mg EDTA-Na ₂ • 2H ₂ O und lösen sich in 50 ml deionisiertem Wasser. Lagerung bei Raumtemperatur.
2. KCl depolarisierenden Lösung.
   1. Bereiten K10X Stammlösung: 3,69 g NaCl, 18,64 g KCl, 0,36 g MgSO ₄ wasserfrei, 0,41 g KH ₂ PO _4, 0,46 g CaCl ₂ • 2H ₂ O. Man löst in 250 ml VE-Wasser. Lagerung bei Raumtemperatur.
   2. Für 100 ml KCl endgültige Lösung depolarisierenden 1X: Man löst 0,21 NaHCO _3, 0,18 g Glucose in 90 ml deionisiertem Wasser. 10 ml K10X Stammlösung. In 95 ul 500X EDTA-Lösung. Gut mischen. Lagern bei 4 ° C. Verwenden Sie innerhalb einer Woche.
3. Bereiten Sie frischen HEPES-PSS-Lösung am Tag des Experiments (für 1 Liter).
   1. 6,96 g NaCl, 0,35 g KCl, 0,288 g MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,1605 g KH ₂ PO _4, 2,38 g HEPES. Man löst in 100 mlentionisiertem Wasser. Als Kolben A.
   2. 0,312 g CaCl ₂ • 2H ₂ O. Man löst in 100 ml VE-Wasser. Markieren Sie als Kolben B.
   3. 1,25 g NaHCO _3, 0,991 g Glucose. Man löst in 98 ml deionisiertem Wasser. Markieren Sie als Kolben C.
4. 2 ml EDTA 500X in Kolben C. Nehmen Sie 700 ml VE-Wasser in einem großen Kolben. Gießen Inhalt des Kolbens A, B und C in großen Kolben mit kontinuierlichem Vortexen. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4.

2. Drogen verwendet

1. Phenylephrin (10 ^-2 M): Man löst 20,37 mg in 10 ml deionisiertem Wasser. Aliquot 1 ml und bei -80 ° C Seriell verdünnt auf 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5 und 10 ^-6 mol / L am Tag des Experiments erhalten.
2. Acetylcholin (10 ^-2 M): Man löst 18,17 mg in 10 ml deionisiertem Wasser. Aliquot 1 ml und bei -80 ° C Serienmäßig verdünnen bis 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5 und 10 ^-6 erhaltenmol / L am Tag des Experiments.

3. Mäuse

Männlich WT und sGCα ₁ ^{- / -} Mäusen auf der S6 und B6 Hintergrund wurden in dieser Studie untersucht. Die sGCα ₁ ^{- / -} wurden wie zuvor beschrieben ^4,5 generiert. Gehäuse und Verfahren mit Versuchstieren (Mäusen) wurden durch den Unterausschuss für Forschung Animal Care of Massachusetts General Hospital, Boston, MA genehmigt.

4. Measurement of Vascular Reaktivität in Mesenterialarterie

1. Euthanize die Mäuse mit Pentobarbital (200 mg / kg, ip). Öffnen Sie die Bauchhöhle und sezieren die mesenterialen Gewebe. Isolieren und sezieren eine Mesenterialarterie der ^3. Ordnung frei von Binde-und Fettgewebe, und legen Sie die Arterie in eiskaltem HEPES-PSS-Lösung voräquilibriert mit 95% O _2/5% CO ₂ für 15 min. Cut Ringe von 2-3 mm Länge ohne Verzweigung von der mesenterialenArterie. Die Unterscheidung zwischen Arterien und Venen in Mikrogefäßen Ebene ist problematisch, wenn kein Blut in den Gefäßen. Wir empfehlen daher, die Identifizierung des Schiffes, während es noch intakt ist in der Tierwelt vor Sezieren it out.
2. Füllen Sie die Kanülen Glas in der Druck Myographions Kammer (DMT Modell 110P & 11P Version 1.31, Abbildung 2) mit HEPES-PSS-Lösung mit Hilfe einer 10 ml Spritze durch Ein-und Auslassventile. Füllen von Kanüle sollte sanft und sorgfältig durchgeführt werden, da übermäßiger Druck das fragile Wandler mit Kanülen beschädigen können. Nach dem Befüllen Kanülen schließen sowohl Einlass-und Auslassventile fest.
3. Montieren Sie ein Ende des Schiffes auf den rechten Kanüle und sorgfältig binden Sie es mit einem feinen Strang Nylonnaht. Mit Hilfe einer Spritze, spülen und füllen Sie das Gefäß mit HEPES-Lösung über Einlassventil. Bringen Sie in der linken Kanüle näher an das Schiff und montieren Sie das andere Ende des Schiffes auf sie. Binden Sie es mit Nylonnaht. Füllendie Kammer mit bis zu 10 ml mit HEPES-Lösung. Überprüfen Sie für das Leck durch leichtes Drücken HEPES Lösung über Einlassventil mit Hilfe einer Spritze.
4. Installieren der Kammer auf der Myographions und unter der Videokamera. Starten Sie den Sauerstoff und Wärme (37 ° C) in der Kammer. Schließen Sie das Einlassventil mit Schlauch P1 aus dem ersten HEPES Lösung Reservoir, während das Ventil geschlossen ist. Lassen Sie keine Blase und Pass-Lösung durch das Rohr, bis keine Luftblasen im Schlauch sind. Öffnen Sie das Ventil.
5. Schließen Sie das Ventil der linken Kammer mit Rohr P2 aus Druckregler. Auch auf eventuelle Blasen. Es sollte keine Blasen oder Undichtigkeiten im gesamten System.
6. Gehen Sie auf die Druck-Menü auf der Myo-Interface-Panel oder in der Software und schalten Sie die Pumpe, während Ausschalten der Strömung.
7. Öffnen Sie das Programm und klicken Sie auf zu sammeln. Schiff sollte auf dem Bildschirm jetzt (Abbildung 3) zu sehen. Das Schiff ist sichtbar mit einer Kamera auf einem Mikroskop ausgestattet, so dass monitoring und Analyse der Gefäßlumen, Gefäßdurchmesser und Wandstärke.
8. Schrittweise Anhebung des interluminal Druck über die P1 Ventil indem Sie P1 Druck im Myo-Interface-Panel oder im Programm und geben Sie den Druck-Wert wie folgt; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Schiff irgendwann neigt zu drehen oder falten, während der Druck steigt, die Spannung einstellen oder sich anstrengen, entsprechend mit Hilfe der vertikalen oder Längsrichtung Mikropositionierer (Abbildung 2). Equilibrieren das Gefäß bei 60 mmHg und 37 ° C für mindestens 45 min. Ändern Sie die Badlösung einmal mit vorgewärmten HEPES während der Äquilibrierung.
9. Bewerben 10 ml KCl depolarisierenden Lösung, vorgewärmt auf 37 ° C, um das Bad zu voll depolarisieren glatten Muskelzellen und eine maximale Verengung. Nach stabile Verengung, spülen Sie die Badewanne mit HEPES Lösung 3 mal alle 10 min.
10. Überprüfen Sie die Tragfähigkeit des Schiffes und die Integrität des Endothels durch stabile und reproduzierbareible Antworten auf die Zugabe von Phenylephrin (10 ^-5 M) und Acetylcholin (10 ^-5 M). Spülen 3 mal mit HEPES-Lösung alle 10 min.
11. In Phenylephrin (10 ^-5 M), um den Behälter preconstrict, und wenn ein stabiler Einschnürung erhalten wurde, führen eine kumulative Konzentrations-Antwort-Kurve Vasodilatation (CRC) durch sequentielle Zugabe von steigenden Dosen von Acetylcholin (10 ^-9, 3 x 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 x 10 ^-8, 10 ^-7, 3 x 10 ^-7, 10 ^-6, 3 x 10 ^-6 und 10 ^-5 M). Nach der letzten Dosis, spülen 3 mal mit HEPES-Lösung alle 10 min vor Beginn der neuen CRC.
12. Bestimmen Sie die passive Lumendurchmesser indem Ca ^{2 +-freien} PSS mit 2 mM EGTA. Aus dem aufgenommenen Kurven Maßnahme Lumendurchmesser für jede Dosis (Abbildung 4), die verwendet wird, um alle Parameter berechnet werden.
13. Drück alle Acetylcholin Entspannung Antworten als percentage Änderung Lumendurchmesser nach Phenylephrin preconstriction mit der Differenz zwischen Calcium-freier Durchmesser und Durchmesser nach Phenylephrin Verengung Vergleich unter Verwendung der folgenden Gleichung:
14. Prozentual Dilatation = 100% x [(D _x - D _i) / (D _Ca-frei - D _i)], wobei D die gemessene Lumen Durchmesser und x, i, und Ca-frei bezeichnen arterielle Durchmesser bei jeder Dosis des Agonisten (x), Phenylephrin anfänglichen Durchmesser folgenden Verengung (i), und in Ca ^{2 +-freien} Puffer (Ca-frei).

5. Statistische Analyse

Alle kontinuierlichen Messungen sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Das vaskuläre Reaktivität in Mesenterialarterien wird durch wiederholte Messungen Zwei-Wege-ANOVA analysiert. In allen Fällen, P <0,05 als statistisch signifikant ist.

Ergebnisse

NO ist zentral in Aufrechterhaltung des Blutdrucks Homöostase sowohl bei Menschen als ⁶ und in Tiermodellen ⁷ beteiligt. Die Fähigkeit von NO auf vaskuläre Relaxation der glatten Muskulatur steuern durch lösliche Guanylatzyklase (sGC), ein Häm-haltigen Enzym, das cGMP heterodimeres ⁸ erzeugt vermittelt. Kürzlich wurde ein Blutdruck-modifizierende genetische Variante in einem Ort, der die sGCα ₁ und sGCβ _1-Gene enthält identifiziert, die die Relevanz der sGC...

Diskussion

Mäuse sind die experimentellen Modell der Wahl für viele Forscher, zum Teil wegen der Möglichkeit, genetische Veränderungen, wodurch Mausmodelle für menschliche Pathophysiologie einzuführen. Die vasoaktiven Status kleinen Widerstand aber nicht von größeren Schiffen Leitung weitgehend definiert die Regulation des Blutflusses im ganzen Gefäßsystem ^11. Die Größe des Widerstands in Arterien Kleintiere, wie Mäuse, verhindert die Verwendung eines Drahtes Myographions mikrovaskuläre Funktion zu untersu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT