Valutare Murino Resistenza Funzione Arteria Utilizzando myography Pressione

Riepilogo

In myography pressione, un piccolo segmento intatta di una nave è attaccato su due piccole cannule e pressurizzato ad una pressione luminale adatto. Qui, descriviamo il metodo per misurare la risposta di vasodilatazione del mouse 3 ^Rd Ordine arterie mesenteriche in c57 e sGCα _{1 - / - Topo, utilizzando myography pressione.}

Abstract

Sistemi miografo pressione sono squisitamente utili nella valutazione funzionale di piccole arterie, pressurizzato ad una pressione transmurale adatto. La condizione vicino fisiologico raggiunto nel myography pressione permette la caratterizzazione approfondita delle risposte intrinseche a stimoli farmacologici e fisiologici, che possono essere estrapolati per il comportamento in vivo del letto vascolare. Miografo pressione ha diversi vantaggi rispetto myographs filo convenzionali. Ad esempio, vasi di resistenza più piccoli possono essere studiate a pressioni endoluminali strettamente controllati e fisiologicamente rilevanti. Qui, si studia la possibilità di ³ ° ordine arterie mesenteriche (3-4 mm di lunghezza), preconstricted con fenilefrina, a vaso-rilassarsi in risposta alla acetilcolina. Arterie mesenteriche sono montati su due cannule collegate ad un sistema pressurizzato e sigillato che viene mantenuta a pressione costante di 60 mmHg. Il diametro del lume ed esterno del vaso sono continuouSly ha registrato con una videocamera, permettendo reale quantificazione tempo della vasocostrizione e vasodilatazione in risposta alla fenilefrina e acetilcolina, rispettivamente.

Per dimostrare l'applicabilità di myography pressione per studiare l'eziologia della malattia cardiovascolare, abbiamo valutato funzione vascolare endotelio-dipendente in un modello murino di ipertensione sistemica. Topi deficienti in α ₁ subunità della guanilato ciclasi solubile (sGCα ₁ ^{- / -)} sono ipertesi quando su un (S6) sfondo 129S6 (sGCα ₁ ^-/-S6), ma non quando su un C57BL / 6 (B6) sfondo (sGCα ₁ ^-/-B6). Utilizzando myography pressione, dimostriamo che sGCα risultati ₁ da carenza di alterata vasodilatazione endotelio-dipendente. La disfunzione vascolare è più pronunciata in sGCα ₁ ^-/-S6 che in sGCα ₁ ^-/-B6 topi, probabilmente CONTRIBUZIONEng per la pressione sanguigna più alta in sGCα ₁ ^-/-S6 che in sGCα ₁ ^-/-B6 topi.

Myography pressione è una tecnica relativamente semplice, ma sensibile e meccanicamente utile che può essere utilizzato per valutare l'effetto di vari stimoli sulla contrazione vascolare e relax, aumentando così la nostra comprensione dei meccanismi alla base della malattia cardiovascolare.

Introduzione

Sistemi miografo pressione sono utilizzati per misurare la funzione fisiologica e le proprietà delle piccole arterie, vene e altre navi. Un piccolo segmento intatta di un'arteria o vena è attaccato su due piccole cannule di vetro e pressurizzato ad una pressione luminale sufficiente tenendo il vaso di mantenere la maggior parte del suo nelle caratteristiche vivo (figure 1 e 2). La condizione vicino fisiologica in un miografo pressione riflette il comportamento in vivo del letto vascolare, permettendo lo studio delle proprietà intrinseche (ad esempio tono miogenica) di vasi isolati. Alcuni dei vantaggi del myography pressione sopra myography filo, dove la contrazione muscolare è valutata con accoppiamento meccanico diretto a un trasduttore di forza ^1, comprendono (i) che micro resistenza arterie, che definiscono la resistenza complessiva sviluppata nel sistema vascolare, possono essere studiati, mentre miografo filo è limitata a grandi arterie conduit, (ii) tcappello il rischio di danneggiare l'endotelio viene ridotta, poichè senza cavi devono essere passati attraverso il lume del vaso, (iii) che la forma naturale del vaso è meglio mantenuta, e (iv) che la dimensione vaso può essere studiato in una vasta gamma di pressioni o sollecitazioni di taglio ^2.

Studiare micro vasi può essere più informativo che studiare grandi arterie conduit per aiutare a capire i meccanismi fisiopatologici e molecolari che contribuiscono al tono vascolare alterata nelle malattie cardiovascolari come l'ipertensione. Per esempio, danno della funzione endoteliale associata con l'alimentazione topi una dieta ricca di grassi per 8 settimane potrebbe essere dimostrata in 2 ^nd-ordine mesenterici arterie ³ ma non in anelli aortici (Figura 3). Un altro vantaggio di myography pressione che è intrinseco miogenico costrizione del vaso pressurizzato è presente, e che il ruolo e la funzione dell'endotelio in questo fenomeno può essere studiato. Qui, descrIBE l'uso di una pressione di studiare miografo reattività vascolare del topo mesenterici ³ ° ordine arterie di resistenza in una cornice di ossido nitrico compromessa (NO)-cGMP segnalazione.

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Protocollo

1. Preparazione della soluzione

1. 500X EDTA magazzino: pesare 500 mg di EDTA-Na ₂ • 2H ₂ O e sciogliere in 50 ml di acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente.
2. KCl soluzione depolarizzante.
   1. Preparare K10X soluzione di riserva: 3,69 g di NaCl, 18,64 g di KCl, 0,36 g di _MgSO4 anidro, 0,41 g di KH ₂ PO _4, 0.46 g di CaCl ₂ • 2H ₂ O. Sciogliere in 250 ml di acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente.
   2. Per 100 ml di KCl definitiva soluzione 1X depolarizzante: sciogliere 0,21 _NaHCO3, 0,18 g di glucosio in 90 ml di acqua deionizzata. Aggiungere 10 ml di soluzione madre K10X. Aggiungere 95 ml di soluzione di EDTA 500X. Mescolare bene. Conservare a 4 ° C. Utilizzare entro una settimana.
3. Preparare una soluzione fresca HEPES-PSS, il giorno di esperimento (per 1 litro).
   1. 6,96 g di NaCl, 0,35 g KCl 0,288 g _MgSO4 • 7H ₂ O, 0,1605 g di KH ₂ PO _4, 2.38 g HEPES. Sciogliere in 100 mlacqua deionizzata. Segna come pallone A.
   2. 0,312 g di CaCl ₂ • 2H ₂ O. Sciogliere in 100 ml di acqua deionizzata. Segna come pallone B.
   3. 1.25 g _NaHCO3, 0,991 g di glucosio. Sciogliere in 98 ml di acqua deionizzata. Segna come pallone C.
4. Aggiungere 2 ml di 500X EDTA nel pallone C. Prendete 700 ml di acqua deionizzata in un grande pallone. Versare contenuto del pallone A, B e C in grande pallone con vortex continua. Regolare il pH a 7,4 con NaOH.

2. Farmaci utilizzati

1. Fenilefrina (10 ^-2 M): sciogliere 20,37 mg in 10 ml di acqua deionizzata. Aliquota 1 ml e conservare a -80 ° C. Serialmente diluire per ottenere 10 ^{-3, -4} 10, 10 ^-5 e 10 ^-6 mol / L il giorno dell'esperimento.
2. L'acetilcolina (10 ^-2 M): sciogliere 18,17 mg in 10 ml di acqua deionizzata. Aliquota 1 ml e conservare a -80 ° C. Serialmente diluire per ottenere 10 ^{-3, -4} 10, 10 ^-5 e 10 ^-6mol / L il giorno dell'esperimento.

3. Mice

Maschio WT e sGCα ₁ ^{- / -} topi sullo sfondo S6 e B6 sono stati studiati nel corso di questo studio. Il sGCα ₁ ^{- / -} sono stati generati come descritto in precedenza ^4,5. Housing e procedure che coinvolgono animali da esperimento (topi) sono stati approvati dalla sottocommissione per la ricerca Animal Care del Massachusetts General Hospital, Boston, MA.

4. Misura della reattività vascolare in arteria mesenterica

1. Euthanize i topi con pentobarbital (200 mg / kg, ip). Aprire la cavità addominale e sezionare il tessuto mesenterico. Isolare e sezionare una arteria mesenterica di 3 ^° ordine libero di tessuto connettivo e adiposo, e posizionare l'arteria nella gelida HEPES-PSS soluzione pre-equilibrata con il 95% O _2/5% di CO ₂ per 15 min. Tagliare anelli di lunghezza 2-3 mm senza ramificazione dal mesentericoarteria. Differenziazione tra arterie e vene a vasi livello micro è problematico quando non c'è sangue nei vasi. Pertanto, si raccomanda di identificare la nave, mentre è ancora intatto nell'animale prima dissezione fuori.
2. Riempire le cannule di vetro nella camera di pressione miografo (DMT Modello 110P & 11P versione 1.31, Figura 2) con soluzione di HEPES-PSS con l'aiuto di una siringa da 10 ml con valvole di aspirazione e scarico. Riempimento di cannula dovrebbe essere fatto con delicatezza e attenzione, come una pressione eccessiva può danneggiare il fragile trasduttore collegato al cannule. Dopo aver riempito cannule chiudere sia di aspirazione e valvole di scarico ermeticamente.
3. Montare una estremità della nave sulla cannula destra e legarlo con cura con un bel filo di sutura in nylon. Con l'aiuto di una siringa, lavare e riempire il serbatoio con la soluzione di HEPES tramite valvola di aspirazione. Portare nella cannula sinistra più vicino al recipiente e montare l'altra estremità del vaso su di esso. Legarlo con sutura in nylon. Riempirela camera con un massimo di 10 ml con la soluzione di HEPES. Verificare la tenuta spingendo delicatamente soluzione HEPES tramite valvola di aspirazione con l'aiuto di una siringa.
4. Installare la camera sul miografo e sotto la videocamera. Avviare l'ossigeno e calore (37 ° C) nella camera. Collegare la valvola di aspirazione con il tubo P1 dalla prima soluzione serbatoio HEPES, mentre la valvola è chiusa. Lasciate ogni bolla e la soluzione passa attraverso il tubo fino a quando non vi siano bolle nel tubo. Aprire la valvola.
5. Collegare la valvola sinistra della camera con il tubo P2 proveniente dal regolatore di pressione. Controllare di nuovo per le bolle. Non ci dovrebbe essere eventuali bolle o perdite in tutto il sistema.
6. Vai al menu di pressione sul pannello di mio-interfaccia o nel software e accendere la pompa mentre si accende il flusso.
7. Aprire il programma e fare clic su Raccogli. Nave deve essere visto sullo schermo ora (Figura 3). Il vaso è visualizzato con una telecamera montata su un microscopio, permettendo monitoring e analisi del lume del vaso, diametro del vaso, e spessore.
8. Aumentare gradualmente la pressione interluminal tramite la valvola P1 selezionando pressione P1 nel pannello di mio-interfaccia o nel programma e immettere il valore di pressione come segue, 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Qualche vaso tende a torcere o convolute, mentre la pressione è in aumento; regolare la tensione o la tensione di conseguenza, con l'aiuto di micropositioner verticale o longitudinale (Figura 2). Equilibrare l'imbarcazione a 60 mmHg e 37 ° C per almeno 45 min. Cambiare la soluzione del bagno una volta con HEPES preriscaldate durante l'equilibrazione.
9. Applicare 10 ml di soluzione di KCl depolarizzanti, preriscaldato a 37 ° C, al bagno per depolarizzare pienamente cellule muscolari lisce e di ottenere la massima costrizione. Dopo costrizione stabile, lavare il bagno con una soluzione di HEPES 3 volte ogni 10 min.
10. Verificare la fattibilità della nave e l'integrità dell'endotelio da parte stabile e riproduttivarisposte commestibili all'aggiunta di fenilefrina (10 ^-5 M) e acetilcolina (10 ^-5 M). Risciacquare 3 volte con soluzione di HEPES ogni 10 min.
11. Aggiungere fenilefrina (10 ^-5 M) per preconstrict il vaso, e quando una costrizione stabile è stato ottenuto, eseguire una curva concentrazione-vasodilatazione cumulativo (CRC) per aggiunta sequenziale di dosi crescenti di acetilcolina (10 ^-9, 3 x 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 x 10 ^-8, 10 ^-7, 3 x 10 ^-7, 10 ^-6, 3 x 10 ^-6 e 10 ^-5 M). Dopo l'ultima somministrazione, lavare 3 volte con soluzione di HEPES ogni 10 min prima di iniziare il nuovo CRC.
12. Determinare il diametro del lume passiva mediante l'applicazione di Ca ^{2 +} PSS-free contenenti 2 mM EGTA. Dal tracciati registrata misura diametro del lume per ogni dose risposta (Figura 4), ​​che verrà utilizzato per calcolare tutti i parametri.
13. Esprimere tutte le risposte di rilassamento acetilcolina come perccambiamento entage in diametro del lume dopo fenilefrina preconstriction confronta con la differenza tra il diametro priva di calcio e di diametro dopo fenilefrina costrizione, utilizzando la seguente equazione:
14. Percentuale dilatazione = 100% x [(P _x - D _i) / (D _Ca-free - D _i)], dove D è il diametro del lume misurato e x, i, e Ca-libera denotare diametri arteriosi ad ogni dose di agonista (x), segue iniziale diametro costrizione fenilefrina (i), in Ca ^{2 +-tampone} libero (Ca-libero).

5. Analisi statistica

Tutte le misurazioni continue sono espressi come media ± SEM. La reattività vascolare in arterie mesenteriche è analizzato da misure ripetute ANOVA a due vie. In tutti i casi, P <0.05 è considerato statisticamente significativo.

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Risultati

NO è coinvolto centrale nel mantenimento dell'omeostasi pressione sanguigna sia nell'uomo ⁶ e ⁷ in modelli animali. La capacità di NO per il controllo vascolare rilassamento della muscolatura liscia è mediata da guanilato ciclasi solubile (SGC), un enzima eterodimerica contenenti eme che produce cGMP ^8. Recentemente, una pressione sanguigna modificando variante genetica è stata identificata in un luogo che contiene il sGCα ₁ e sGCβ ₁ geni, illustrando ...

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Discussione

I topi sono il modello sperimentale di scelta per molti ricercatori, in parte a causa della possibilità di introdurre modifiche genetiche, generando modelli murini di fisiopatologia umana. Lo stato vasoattiva di piccola resistenza, ma non di più grandi vasi conduit definisce in gran parte la regolazione del flusso di sangue in tutto il sistema vascolare ^11. Le dimensioni delle arterie di resistenza in piccoli animali, come topi, impedisce l'uso di un filo miografo per studiare la funzione microvascolare...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT