הערכת תפקוד עורקי התנגדות Murine באמצעות לחץ Myography

Summary

בmyography לחץ, קטע קטן בשלמות של כלי הוא רכוב על גבי שני cannulas קטן ודחוס כדי luminal לחץ מתאים. כאן, אנו מתארים את השיטה כדי למדוד את התגובה של vasorelaxation העכבר 3 ^Rd עורקי mesenteric סדר בC57 וsGCα _{1 - / - עכברים באמצעות myography לחץ.}

Abstract

מערכות myograph לחץ הן שימושיות להפליא בהערכה התפקודית של עורקים קטנים, דחוסים כדי transmural לחץ מתאים. המצב הפיזיולוגי הקרוב שהושג בלחץ myography מאפשר אפיון מעמיק של תגובות לגירויים פנימיות תרופתיים ופיסיולוגיים, שניתן להסיק בהתנהגות vivo של מיטת כלי הדם. יש לחץ myograph מספר יתרונות על פני myographs תיל קונבנציונלי. לדוגמה, ניתן ללמוד כלי התנגדות קטנים יותר בלחצי intraluminal פיקוח הדוק ורלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. כאן, אנחנו לומדים את היכולת של 3 ^rd עורקי סדר mesenteric (מ"מ אורך 3-4), preconstricted עם phenylephrine, להרחבת כלי דם, להירגע בתגובה לאצטילכולין. עורקי mesenteric הם רכובים על שני cannulas מחוברים למערכת בלחץ והאטומה שנשמרה בלחץ קבוע של 60 מ"מ כספית. קוטר הלום והחיצוני של הכלי הוא continuouערמומי הוקלט באמצעות מצלמת וידאו, המאפשר כימות בזמן אמת של כיווץ כלי הדם וvasorelaxation בתגובה לphenylephrine ואצטילכולין, בהתאמה.

כדי להדגים את הישימות של myography לחץ ללמוד אטיולוגיה של מחלה קרדיווסקולרית, שהערכנו תפקוד כלי דם האנדותל תלוי במודל עכברי של יתר לחץ דם מערכתי. עכברים חסרים במקטע ₁ α של cyclase guanylate המסיס (sGCα ₁ ^{- / -)} הם יתר לחץ דם, כאשר ברקע (S6) 129S6 ₍₁ sGCα ^-/-S6) אבל לא כאשר ב/ 6 C57BL (B6) רקע (sGCα ₁ ^-/-B6). שימוש myography לחץ, אנו מראים כי sGCα תוצאות _1-מחסור בvasorelaxation האנדותל התלוי לקוי. תפקוד לקוי של כלי הדם הוא בולט יותר _ב1 ^-/-S6 sGCα מאשר _ב1 sGCα ^-/-B6 עכברים, contributi הסבירng ללחץ הדם גבוה יותר _ב1 ^-/-S6 sGCα מאשר _ב1 ^-/-B6 עכברי sGCα.

myography לחץ הוא טכניקה פשוטה יחסית, אך רגישה ומכניסטי שימושית שניתן להשתמש בו כדי להעריך את ההשפעה של גירויים שונים על התכווצות והרפיה של כלי דם, ובכך משלים תובנות את המנגנונים בבסיס מחלת לב וכלי דם.

Introduction

מערכות myograph לחץ משמשות למדידת התפקוד הפיזיולוגי ומאפיינים של עורקים קטנים, ורידים וכלי שיט אחרים. קטע קטן שלם של עורק או וריד הוא רכוב על גבי שני cannulas זכוכית קטן ודחוס כדי luminal לחץ מתאים, המאפשר את הכלי כדי לשמור על רובו במאפייני vivo (איורים 1 ו -2). המצב הפיזיולוגי הקרוב בmyograph לחץ משקף בהתנהגות vivo של מיטת כלי הדם, ומאפשר החקירה של מאפיינים פנימיים (טון myogenic למשל) כלי מבודדים. חלק מן היתרונות של myography לחץ מעל myography תיל, שבו התכווצות שרירים נבחנת על ידי צימוד מכאני ישיר למתמר ¹ כוח, כוללים (i) שעורקי התנגדות מיקרו, אשר מגדירים את ההתנגדות הכוללת פיתחה במערכת כלי דם, ניתן ללמוד, ואילו myograph החוט מוגבל לעורקי צינור גדולים יותר, (ii) tכובע את הסיכון לנזק האנדותל מצטמצם מאז חוטים לא צריכים להיות מועברים באמצעות לום הכלי, (iii) שהצורה הטבעית של הספינה נשמר טוב יותר, וכן (iv) שממד כלי ניתן ללמוד במגוון רחב של לחצים או מאמץ גזירה ^2.

לומד כלי מיקרו יכול להיות אינפורמטיבי יותר מאשר ללמוד עורקי צינור גדולים יותר כדי לעזור להבין את הפתופיזיולוגיה והמנגנונים מולקולריים התורמים לצליל כלי דם משתנה במחל לב וכלי דם כגון יתר לחץ דם. לדוגמה, פגיעה בתפקוד האנדותל קשורים להאכלת עכברים בדיאטה עתירה שומן במשך 8 שבועות יכולה להיות הפגינה בעורקי 2 ^nd מסדר mesenteric ³ אך לא בטבעות אבי העורקים (איור 3). יתרון נוסף של myography לחץ הוא שהתכווצות myogenic הפנימית של הכלי בלחץ קיימת, ושניתן ללמוד את התפקיד והתפקוד של האנדותל בתופעה זו. כאן, אנו DescrIBE שימוש myograph לחץ ללמוד תגובתיות כלי דם עורקים של 3 ^rd סדר mesenteric עכבר התנגדות בהגדרה של תחמוצת חנקן לקויה (NO)-cGMP איתות.

Protocol

1. הכנת הפתרון

1. מניית EDTA 500X: שוקל 500 מ"ג EDTA-Na ₂ • 2H ₂ O ומתמוסס במי 50 מיליליטר deionized. לאחסן בטמפרטורת חדר.
2. KCl depolarizing פתרון.
   1. הכן פתרון מניות K10X: 3.69 גרם NaCl, 18.64 גר 'KCl, 0.36 MgSO ₄ נטול מים G, G KH ₂ PO ₄ 0.41, 0.46 גרם CaCl ₂ • 2H ₂ O. מתמוסס במי deionized 250 מ"ל. לאחסן בטמפרטורת חדר.
   2. לKCl הסופי 100 מיליליטר depolarizing פתרון 1X: ממיסים 0.21 ₃ NaHCO, גלוקוז 0.18 גרם במי 90 מיליליטר deionized. הוסף 10 מ"ל של פתרון מניות K10X. הוסף 95 μl של פתרון EDTA 500X. מערבבים היטב. חנות ב 4 ° C. השתמש בתוך שבוע אחד.
3. הכן את פתרון HEPES שPSS טרי ביום של ניסוי (עבור 1 ליטר).
   1. 6.96 גרם NaCl, 0.35 גרם KCl, 0.288 גרם MgSO ₄ • 7H ₂ O, _{4, 2} 0.1605 2.38 HEPES גרם KH PO גרם. ממיסים ב100 מ"למים deionized. מארק כא בקבוק
   2. 0.312 גרם CaCl ₂ • 2H ₂ O. מתמוסס במי deionized 100 מ"ל. סמן כבקבוקון B.
   3. 1.25 גר _'3 NaHCO, גרם גלוקוז 0.991. מתמוסס במי 98 מיליליטר deionized. סמן כבקבוק ג
4. הוסף 2 מ"ל של 500X EDTA בבקבוק C. קח מים 700 מ"ל deionized בבקבוק גדול. יוצקים תוכן של בקבוק, B ו-C בבקבוק גדול עם vortexing הרציף. התאם את ה-pH 7.4 עם NaOH.

2. תרופות המשמשות

1. Phenylephrine (10 ^-2 מ '): ממיסים 20.37 מ"ג במי deionized 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C. סדרנו לדלל להשיג 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5, ומול / L 10 ^-6 ביום הניסוי.
2. אצטילכולין (10 ^-2 מ '): ממיסים 18.17 מ"ג במי deionized 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C. סדרנו לדלל להשיג 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5, ו10 ^-6מול / ליטר ביום של ניסוי.

3. עכברים

WT זכר _ו1 sGCα ^{- / -} עכברים על רקע S6 ו-B6 נחקרו לאורך מחקר זה. SGCα ₁ ^{- / -} נוצרה כמתואר ^4,5 בעבר. שיכון ונהלים הקשורים חיות ניסוי (עכברים) אושרו על ידי ועדת המשנה לטיפול בבעלי חיים למחקר של בית החולים הכללי במסצ'וסטס, בוסטון, מסצ'וסטס.

4. מדידה של תגובתיות כלי דם בעורק mesenteric

1. להרדים את העכברים עם pentobarbital (200 מ"ג / ק"ג, IP). פתח את חלל הבטן ולנתח את רקמת mesenteric. בודד ולנתח עורק mesenteric של 3 ^rd סדר ללא חיבור ורקמת שומן, ולמקם את העורק בקר כקרח HEPES שPSS פתרון מראש equilibrated עם 95% O ₂ / CO ₂ למשך 15 דקות 5%. לחתוך טבעות באורך 2-3 מ"מ ללא הסתעפות מmesentericעורק. הבחנה בין עורקים וורידים ברמת כלי מיקרו היא בעייתית כאשר אין דם בכלי. לכן, אנו ממליצים זיהוי הכלי בזמן שהוא עדיין שלם בחיה לפני לנתח אותו החוצה.
2. מלא את cannulas הזכוכית בלחץ myograph קאמרי (DMT דגם 110P & 11P גרסה 1.31, איור 2) עם פתרון HEPES-PSS בעזרת מזרק 10 מ"ל דרך שסתומי יניקה ולשקע. מילוי של צינורית צריך להיעשות בעדינות ובזהירות כלחץ מופרז עלול לגרום נזק לרירית המתמר המחובר לcannulas. לאחר מילוי cannulas לסגור שני שסתומי יניקה ולשקע בחוזקה.
3. הר קצה אחד של הכלי על צינורית נכונה ולקשור אותו בזהירות עם גדיל קנס אחד תפר ניילון. בעזרת מזרק, לשטוף ולמלא את הכלי עם פתרון HEPES דרך שסתום יניקה. להביא את הצינורית השמאלית קרוב יותר לכלי ולעלות בצד השני של ספינה על גבי זה. לקשור אותו עם תפר ניילון. למלאהתא עם עד 10 מ"ל עם פתרון HEPES. בדקו אם יש דליפה בעדינות על ידי דוחף פתרון HEPES דרך שסתום יניקה בעזרת מזרק.
4. התקן את התא על myograph ותחת מצלמת וידאו. התחל את החמצן וחום (37 מעלות צלזיוס) בחדר. חבר את שסתום הכניסה עם P1 צינור ממאגר פתרון HEPES הראשון, בעוד שסתום סגור. בואו כל בועה ולעבור פתרון דרך הצינור עד שאין בועות בצינור. פתח את השסתום.
5. חבר את השסתום השמאלי של החדר עם P2 הצינור מגיע מוסת לחץ. שוב לבדוק אם כל בועות. לא צריך להיות כל בועות או דליפה במערכת כולה.
6. לכו לתפריט הלחץ בלוח ממשק מיו או בתוכנה ולהפעיל את המשאבה בזמן כיבוי הזרימה.
7. פתח את התכנית ולחץ על לאסוף. כלי השיט יש לראות על המסך עכשיו (איור 3). הכלי הוא דמיינו עם מצלמה מצוידת במיקרוסקופ, ומאפשר monitoring וניתוח של לומן כלי, קוטר כלי, ועובי קיר.
8. בהדרגה להעלות את לחץ interluminal דרך שסתום P1 על ידי בחירה בלחץ P1 בלוח ממשק מיו או בתכנית ולהזין את ערך הלחץ כדלקמן; 5 מ"מ כספית → 10 → 20 → 40 → 60 מ"מ כספית. כלי מתישהו נוטים לעוות או convolute תוך לחץ גובר; להתאים את המתח או להתאמץ בהתאם בעזרת micropositioner האנכית או אורך (איור 2). לאזן את הספינה על 60 מ"מ כספית ו37 מעלות צלזיוס לפחות למשך 45 דקות. לשנות את פתרון האמבטיה פעם אחת עם HEPES מראש חמם במהלך איזון.
9. החל 10 מ"ל של תמיסת depolarizing KCl, prewarmed על 37 מעלות צלזיוס, לאמבטיה לdepolarize מלא תאי שריר חלק ולהשיג כיווץ מקסימאלי. לאחר התכווצות יציבה, יש לשטוף את האמבטיה עם HEPES פתרון 3 פעמים בכל 10 דקות.
10. בדקו את הכדאיות של הכלי ותקינותו של האנדותל ידי יציב וreproducתגובות נראות לתוספת של phenylephrine (10 ^-5 ז) ואצטילכולין (10 ^-5 מ '). לשטוף 3 פעמים עם HEPES פתרון כל 10 דקות.
11. הוסף phenylephrine (10 ^-5 מ ') לpreconstrict כלי, וכאשר הושגה התכווצות יציבה, לבצע עקומת תגובת ריכוז התרחבות מצטברת (CRC) על ידי תוספת רציפה של מנות הולכות וגדלות של אצטילכולין (10 ^-9, 3 x 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 x 10 ^-8, 10 ^-7, 3 x 10 ^-7, 10 ^-6, 3 x 10 ^-6, ו10 ^-5 מ '). לאחר המנה האחרונה, לשטוף 3 פעמים עם פתרון HEPES כל 10 דקות לפני ההתחלה החדשה CRC.
12. לקבוע את קוטר הלום הפסיבי על ידי יישום Ca ^{2 +} ללא PSS המכיל EGTA 2 מ"מ. מקוטר לום מידת העתקי הקלטות עבור כל תגובת מינון (איור 4), שבו תשתמש כדי לחשב את כל הפרמטרים.
13. בטא את כל תגובות ההרפיה אצטילכולין כPERCשינוי entage בקוטר לומן לאחר preconstriction phenylephrine לעומת ההבדל בין קוטר וקוטר נטולי סידן לאחר התכווצות phenylephrine, באמצעות המשוואה הבאה:
14. אחוז התרחבות = 100% X [(ע _x - D _i) / _{(Ca-D חופשי} - D) _i], כאשר D הוא קוטר הלום המדוד וX, אני, וללא Ca נסמן קטרי עורקים בכל מינון של אגוניסט (X), הבא קוטר ראשוני phenylephrine התכווצות (ט), ובCa ^{2 +} ללא חיץ (CA-חינם).

5. ניתוח סטטיסטי

כל המדידות הרציפות באות לידי ביטוי כממוצע ± SEM. תגובתיות כלי הדם בעורקי mesenteric מנותחת על ידי חוזרים ונשנים-אמצעים דו סטרי ANOVA. בכל המקרים, P <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.

תוצאות

לא מעורב באופן מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס לחץ דם גם בבני אדם ⁶ ו ^-7 במודלים של בעלי חיים. היכולת של NO לשלוט הרפיה שריר חלק של כלי דם מתווכת על ידי מסיס guanylate cyclase (SGC), אנזים heterodimeric המכיל heme שיוצר ⁸ cGMP. לאחרונה, וריאנט גנטי לחץ שינוי הדם זוהה בלוקוס המכיל

Discussion

עכברים הם מודל ניסיוני של בחירה עבור חוקרים רבים, בחלקו בשל האפשרות להציג את השינויים גנטיים, ובכך לייצר מודלים עכבר לפתופיזיולוגיה אנושית. מעמד vasoactive של התנגדות קטנה אך לא של כלי צינור גדולים יותר במידה רבה מגדיר את הוויסות של זרימת דם במערכת כלי הדם ^11. הגודל ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT