Avaliando Murino Resistência Função Usando Miografia Pressão Arterial

Resumo

Em Miografia pressão, um pequeno segmento de um vaso intacto é montado sobre duas pequenas cânulas e pressurizado a uma pressão adequada luminal. Aqui, descrevemos o método para medir a resposta vasorelaxation do mouse 3 ^Rd Ordem artérias mesentéricas em C57 e sGCα _{1 - / - Ratos usando Miografia pressão.}

Resumo

Sistemas myograph pressão são primorosamente útil na avaliação funcional das pequenas artérias, pressurizado a uma pressão transmural adequado. A condição fisiológica perto alcançado em Miografia pressão permite a caracterização aprofundada das respostas intrínsecas a estímulos farmacológicos e fisiológicos, os quais podem ser extrapolados para o comportamento in vivo do leito vascular. Myograph pressão possui diversas vantagens em relação myographs fios convencionais. Por exemplo, os vasos de resistência menores pode ser estudada a pressões intraluminais estritamente controlados e fisiologicamente relevante. Aqui, vamos estudar a possibilidade de 3 ^ª ordem artéria mesentérica (3-4 mm de comprimento), preconstricted com fenilefrina, a vaso-relaxamento em resposta à acetilcolina. Artérias mesentéricas são montados em duas cânulas ligadas ao sistema pressurizado, selado e que é mantida a uma pressão constante de 60 mmHg. O diâmetro do lúmen e o exterior do vaso são Continuously gravado com uma câmara de vídeo, que permite a quantificação da vasoconstrição e relaxação de vasos em resposta a fenilefrina e acetilcolina em tempo real, respectivamente.

Para demonstrar a aplicabilidade do Miografia pressão para estudar a etiologia da doença cardiovascular, avaliou-se a função vascular endotélio-dependente em um modelo murino de hipertensão sistémica. Camundongos deficientes na subunidade α ₁ da guanilato ciclase solúvel (sGCα ₁ ^{- / -)} são hipertensos quando em um (S6) Fundo 129S6 (sGCα ₁ ^-/-S6), mas não quando em um C57BL / 6 (B6) fundo (sGCα ₁ ^-/-B6). Usando Miografia pressão, demonstramos que sGCα ₁ deficiência resulta em alterações na vasorelaxation endotélio-dependente. A disfunção vascular é mais acentuada em sGCα ₁ ^-/-S6 que em sGCα ₁ ^-/-B6 ratos, provavelmente CONTRIBUTOng a maior pressão no sGCα ₁ ^-/-S6 que em sGCα _um ^-/-B6 ratinhos.

Miografia pressão é uma técnica relativamente simples, mas sensível e mecanisticamente útil que pode ser utilizado para avaliar o efeito de diferentes estímulos na contracção e relaxamento vascular, aumentando, assim, o nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à doença cardiovascular.

Introdução

Myograph sistemas de pressão são usadas para medir a função e as propriedades fisiológicas das pequenas artérias, veias e outros recipientes. Um pequeno segmento de uma artéria ou veia intactas é montada sobre dois pequenos cânulas de vidro e pressurizado a uma pressão luminal adequada, permitindo que o recipiente para manter a maior parte do seu características in vivo (Figuras 1 e 2). A condição fisiológica perto num myograph pressão reflecte o comportamento in vivo do leito vascular, o que permite a investigação das propriedades intrínsecas (por exemplo, o tom miogénica) de vasos isolados. Algumas das vantagens da Miografia Miografia pressão ao longo do fio, onde a contração muscular é avaliada através de acoplamento mecânico directo a um transdutor de força ^1, incluem: (i) que as micro artérias de resistência, que definem a resistência global desenvolvido no sistema vascular, podem ser estudadas, enquanto myograph fio está limitado a maiores artérias condutas, (ii) tchapéu o risco de danificar o endotélio é reduzido uma vez que não há necessidade de fios de ser passado através do lúmen do vaso, (iii) que a forma natural do vaso é melhor mantida, e (iv) que dimensão navio pode ser estudado em uma ampla gama de pressões ou estresse de cisalhamento ^2.

Estudar micro vasos pode ser mais informativo do que estudar maiores artérias do conduíte para ajudar a compreender os mecanismos fisiopatológicos e moleculares que contribuem para a alteração do tônus ​​vascular em doenças cardiovasculares, como hipertensão. Por exemplo, a deficiência da função endotelial associada com a alimentação de ratos uma dieta rica em gorduras durante 8 semanas podia ser demonstrado em 2 ^ª ordem artérias mesentéricas ^3, mas não em anéis da aorta (Figura 3). Outra vantagem é que a pressão Miografia constrição miogénica intrínseca do recipiente pressurizado está presente, e que o papel e a função do endotélio para este fenómeno pode ser estudada. Aqui, nós describe o uso de uma pressão myograph para estudar a reactividade vascular mesentérica de rato 3 ^ª ordem artérias resistência numa configuração de óxido nítrico prejudicada (NO)-cGMP sinalização.

Protocolo

1. Preparação da Solução

1. Estoque 500X EDTA: pesar 500 mg EDTA-Na ₂ • 2H ₂ O e dissolver em 50 ml de água deionizada. Guarde à temperatura ambiente.
2. KCl solução despolarizante.
   1. Preparar a solução estoque K10X: 3,69 g NaCl, 18,64 g de KCl, 0,36 g _MgSO4 anidro, 0,41 g KH ₂ PO _4, 0,46 g de _CaCl2 • 2H ₂ O. Dissolve-se em 250 ml de água desionizada. Guarde à temperatura ambiente.
   2. Para 100 ml de solução final de KCl 1X despolarizante: Dissolver 0,21 _NaHCO3, 0,18 g de glicose em 90 ml de água desionizada. Adicionar 10 ml da solução de K10X. Adicionar 95 ul de solução de EDTA 500X. Misturar bem. Armazenar a 4 ° C. É dentro de uma semana.
3. Preparar solução fresca de HEPES-PSS no dia da experiência (para 1 litro).
   1. 6,96 g de NaCl, 0,35 g de KCl, 0,288 g de _MgSO4 • 7H ₂ O, 0,1605 g _de KH ₂ PO _4, 2,38 g de HEPES. Dissolve-se em 100 mlde água desionizada. Marcar como frasco A.
   2. 0,312 g CaCl ₂ • 2H ₂ O. Dissolve-se em 100 ml de água desionizada. Marcar como frasco B.
   3. 1,25 g _{de NaHCO3,} 0,991 g de glicose. Dissolve-se em 98 ml de água desionizada. Marcar como frasco C.
4. Adicionam-se 2 ml de EDTA num frasco de 500X C. Aqui 700 ml de água desionizada num balão de grande. Deite o conteúdo do balão A, B e C em grande balão com vórtex contínuo. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH.

2. Drogas usadas

1. A fenilefrina (10 ^-2 M): Dissolve-se 20,37 mg em 10 ml de água desionizada. Alíquota de 1 ml e armazenar a -80 ° C. Diluir em série para obtenção de 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5 e 10 ^-6 mol / L no dia da experiência.
2. A acetilcolina (10 ^-2 M): Dissolve-se 18,17 mg em 10 ml de água desionizada. Alíquota de 1 ml e armazenar a -80 ° C. Diluir em série para obtenção de 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^{-5, -6} e 10mol / l no dia da experiência.

3. Ratos

Macho WT e sGCα ₁ ^{- / -} murganhos no fundo S6 e B6 foram estudados ao longo deste estudo. O sGCα ₁ ^{- / -} foram gerados como descrito anteriormente ^4,5. Habitação e procedimentos que envolvem animais de laboratório (ratos) foram aprovados pela Subcomissão de Pesquisa Animal Care do Massachusetts General Hospital, Boston, MA.

4. Medição de reatividade vascular em artéria mesentérica

1. Eutanásia dos ratinhos com pentobarbital (200 mg / kg, ip). Abra a cavidade abdominal e dissecar o tecido mesentérica. Isolar e dissecar uma artéria mesentérica de 3 ^ª ordem isenta de tecido conjuntivo e adiposo e colocar a artéria no gelado Hepes PSS solução pré-equilibrada com 95% _de O2 / 5% de CO ₂ durante 15 min. Cortar anéis de 2-3 mm de comprimento, sem ramificação do mesentéricaartéria. A diferenciação entre artérias e veias nível micro vasos é problemático quando não há sangue nos vasos. Portanto, recomendamos identificar a embarcação enquanto ela ainda está intacta no animal antes de dissecá-lo para fora.
2. Preencher as cânulas de vidro na câmara de pressão myograph (DMT Modelo 110P & 11P versão 1.31, Figura 2) com a solução de HEPES-PSS com a ajuda de uma seringa de 10 ml por meio de válvulas de entrada e de saída. Preenchimento de cânula deve ser feito com cuidado e com cuidado, pois a pressão excessiva pode danificar o transdutor frágil ligado a cânulas. Após o preenchimento cânulas fechar tanto de entrada e válvulas de saída com força.
3. Montar uma extremidade do navio para cânula direito e amarrá-lo com cuidado e com um fio fino de fio de náilon. Com a ajuda de uma seringa, lave e preencher o recipiente com solução HEPES através da válvula de admissão. Trazer a cânula esquerda para mais perto do navio e montado na outra extremidade do recipiente sobre ele. Amarre-o com fio de náilon. Preenchera câmara com até 10 ml com a solução de HEPES. Entrada para o vazamento empurrando suavemente solução HEPES, através da válvula de entrada com a ajuda de uma seringa.
4. Instalar a câmara na myograph e sob a câmara de video. Inicie o oxigénio e calor (37 ° C) na câmara. Ligação a válvula de admissão com o tubo de P1 a partir do primeiro reservatório para a solução de HEPES, enquanto a válvula é fechada. Que qualquer bolha e solução passe através do tubo até que não existam bolhas no tubo. Abrir a válvula.
5. Ligação a válvula esquerdo da câmara com o tubo P2 proveniente do regulador de pressão. Novamente verifique se há bolhas. Não deve haver quaisquer bolhas ou vazamento em todo o sistema.
6. Vá para o menu pressão sobre o painel de mio-interface ou no software e ligar a bomba enquanto desligar o fluxo.
7. Abra o programa e clique em Collect. Veículo deve ser visto no ecrã agora (Figura 3). O vaso é visualizado com uma câmara montada num microscópio, permitindo monitoring e análise do lúmen do vaso, o diâmetro do vaso, e a espessura da parede.
8. Aumentar gradualmente a pressão interluminal através da válvula P1 seleccionando pressão P1 no painel de mio-interface ou no programa e insira o valor da pressão da seguinte forma; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Veículo algures tende a torcer ou convolute enquanto a pressão está a aumentar, ajustar a tensão ou tensão de acordo com a ajuda de microposicionador vertical ou longitudinal (Figura 2). Equilibrar a embarcação a 60 mmHg e 37 ° C, pelo menos durante 45 min. Altere a solução do banho uma vez com HEPES pré-aquecido durante equilíbrio.
9. Aplicar 10 ml de solução despolarizante de KCl, pré-aquecida a 37 ° C, para o banho de despolarizar totalmente as células musculares lisas e alcançar a constrição máxima. Depois de constrição estável, lavar a banheira com solução HEPES 3 vezes a cada 10 min.
10. Verificar a viabilidade do vaso e da integridade do endotélio, por estabilidade e reprodutibilidaderespostas comestíveis à adição de fenilefrina (10 ^-5 M) e acetilcolina (10 ^-5 M). Lavar 3 vezes com solução tampão HEPES a cada 10 min.
11. Adicionar fenilefrina (10 ^-5 M) para preconstrict do navio, e quando uma constrição estável foi obtida, efectuar uma curva de resposta de concentração-cumulativa vasodilatação (CDC), por adição sequencial de doses crescentes de acetilcolina (10 ^-9, 3 x 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 x 10 ^-8, 10 ^-7, 3 x 10 ^-7, 10 ^-6, 3 x 10 ^-6 e 10 ^-5 M). Após a última dose, lavar 3 vezes com solução HEPES a cada 10 minutos antes de iniciar novo CRC.
12. Determinar o diâmetro do lúmen passiva através da aplicação de Ca ^{2 +} PSS e contendo 2 mM de EGTA. A partir do diâmetro luminal medida traçados gravado para cada resposta a dose (Figura 4), ​​que será utilizado para calcular todos os parâmetros.
13. Expresse todas as respostas de relaxamento acetilcolina como percentagem mudança no diâmetro do lúmen, após a pré-fenilefrina em comparação com a diferença entre o diâmetro livre de cálcio e diâmetro após constrição fenilefrina, usando a seguinte equação:
14. Dilatação percentual = 100% x [(D _x - D _i) / _{(D-Ca livre} - D _i)], em que D é o diâmetro do lúmen medido e x, i e Ca-livre denotar diâmetros arteriais para cada dose de agonista (x), segue diâmetro inicial fenilefrina constrição (i), e em Ca ^{2 +} tampão livre (Ca-free).

5. Análise Estatística

Todas as medições contínuas são expressos como média ± SEM. A reatividade vascular em artérias mesentéricas é analisada por medidas repetidas ANOVA de duas vias. Em todos os casos, P <0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

NO está envolvido centralmente na manutenção da homeostase da pressão sanguínea tanto em humanos como ⁶ e ^7, em modelos animais. A capacidade do NO para controlar o relaxamento do músculo liso vascular é mediada por guanilato ciclase solúvel (sGC), um enzima heterodimérica contendo heme que gera cGMP ^8. Recentemente, uma pressão sanguínea de modificação variante genética foi identificada num local que contém a sGCα ₁ e genes sGCβ _1, ilustrando a rel...

Discussão

Camundongos são o modelo experimental de escolha para muitos pesquisadores, em parte por causa da possibilidade de introduzir modificações genéticas, gerando modelos de mouse para fisiopatologia humana. O estado vasoativas de pequena resistência, mas não dos vasos maiores conduíte define em grande parte a regulação do fluxo de sangue em todo o sistema vascular ^11. O tamanho das artérias de resistência em animais pequenos, tais como ratos, previne a utilização de um fio myograph para estudar a fun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT