La evaluación de la resistencia murino Función Arterial Utilizando miografía Presión

Resumen

En miografía de presión, un pequeño segmento intacta de un recipiente está montado sobre dos pequeñas cánulas y se presuriza a una presión luminal adecuado. A continuación, se describe el método para medir la respuesta de vasodilatación del ratón 3 ^Rd Orden arterias mesentéricas en c57 y sGCα _{1 - / - Ratones utilizando miografía presión.}

Resumen

Sistemas myograph presión son exquisitamente útiles en la evaluación funcional de las pequeñas arterias, presurizadas a una presión transmural adecuado. La condición fisiológica cerca logrado en miografía de presión permite la caracterización en profundidad de las respuestas intrínsecas a estímulos farmacológicos y fisiológicos, que pueden ser extrapolados al comportamiento in vivo del lecho vascular. Miógrafo de presión tiene varias ventajas sobre myographs de alambre convencionales. Por ejemplo, los vasos de resistencia más pequeños pueden ser estudiados a presiones intraluminales estrictamente controladas y fisiológicamente relevante. A continuación, se estudia la posibilidad de 3 ^ª arterias mesentéricas orden (3-4 mm de largo), preconstricted con fenilefrina, a la vaso-relajación en respuesta a la acetilcolina. Arterias mesentéricas se montan en dos cánulas conectadas a un sistema de presurizado y sellado que se mantiene a presión constante de 60 mm Hg. El diámetro de la luz y el exterior del recipiente son continuously registraron con una cámara de vídeo, lo que permite la cuantificación en tiempo real de la vasoconstricción y la vasodilatación en respuesta a la fenilefrina y la acetilcolina, respectivamente.

Para demostrar la aplicabilidad de miografía de presión para estudiar la etiología de la enfermedad cardiovascular, se evaluó la función vascular dependiente del endotelio en un modelo murino de la hipertensión sistémica. Los ratones deficientes en la subunidad α ₁ de la guanilato ciclasa soluble (sGCα ₁ ^{- / -)} son hipertensos cuando en un (S6) de fondo 129S6 (sGCα ₁ ^-/-S6) pero no cuando en un C57BL / 6 (B6) fondo (sGCα ₁ ^-/-B6). Usando miografía presión, se demuestra que sGCα resultados _{1-deficiencia} en deterioro vasodilatación dependiente del endotelio. La disfunción vascular es más pronunciada en sGCα ₁ ^-/-S6 que en sGCα ₁ ^-/-B6 ratones, probablemente Contributing a la presión arterial más alta en sGCα ₁ ^-/-S6 que en sGCα ₁ ^-/-B6 ratones.

Miografía de presión es una técnica relativamente simple, pero mecánicamente sensible y útil que se puede utilizar para evaluar el efecto de diversos estímulos de contracción y la relajación vascular, aumentando así nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la enfermedad cardiovascular.

Introducción

Myograph sistemas de presión se utilizan para medir la función fisiológica y las propiedades de las pequeñas arterias, venas y otros vasos. Un pequeño segmento intacto de una arteria o vena está montado sobre dos cánulas de vidrio pequeñas y se presuriza a una presión luminal adecuado, permitiendo que el recipiente para mantener la mayoría de sus características in vivo (Figuras 1 y 2). La condición fisiológica en cerca de un miógrafo de presión refleja el comportamiento in vivo de la cama vascular, lo que permite la investigación de las propiedades intrínsecas (por ejemplo, tono miogénico) de vasos aislados. Algunas de las ventajas de miografía de presión sobre miografía de alambre, donde la contracción muscular se evaluó mediante acoplamiento mecánico directo a un transductor de fuerza ^1, incluyen (i) que las micro arterias de resistencia, que definen la resistencia global desarrollado en el sistema vascular, pueden ser estudiados, mientras que los myograph alambre se limita a grandes arterias de conducción, (ii) tsombrero el riesgo de dañar el endotelio se reduce ya que los cables no necesitan ser pasado a través de la luz del vaso, (iii) que la forma natural del vaso se mantiene mejor, y (iv) que la dimensión recipiente puede ser estudiado en una amplia gama de presiones o esfuerzos cortantes ^2.

El estudio de microvasos puede ser más informativo que el estudio de grandes arterias de conducción para ayudar a comprender los mecanismos fisiopatológicos y moleculares que contribuyen al tono vascular alterado en las enfermedades cardiovasculares como la hipertensión. Por ejemplo, deterioro de la función endotelial asociada con la alimentación de ratones con una dieta alta en grasas durante 8 semanas se pudo demostrar en 2 ^º de orden arterias mesentéricas ³ pero no en anillos de aorta (Figura 3). Otra ventaja de miografía de presión que es intrínseca constricción miogénica del recipiente a presión está presente, y que el papel y la función del endotelio en este fenómeno puede ser estudiado. En este sentido, descrIbe el uso de un miógrafo de presión para estudiar la reactividad vascular de ratón mesentéricos 3 ^ª arterias de resistencia de la orden en un entorno de óxido nítrico alterada (NO)-GMPc señalización.

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Protocolo

1. Preparación de la Solución

1. 500X Stock EDTA: peso 500 mg EDTA-Na ₂ • 2H ₂ O y se disuelven en 50 ml de agua desionizada. Guarde a temperatura ambiente.
2. KCl solución despolarizante.
   1. Prepare K10X solución madre: 3,69 g NaCl, 18.64 g de KCl, 0,36 g _MgSO4 anhidro, 0,41 g KH ₂ PO _4, 0,46 g de CaCl ₂ • 2H ₂ O. Disolver en 250 ml de agua desionizada. Guarde a temperatura ambiente.
   2. Para 100 ml KCl solución final 1X despolarización: Disolver 0,21 NaHCO _3, 0,18 g de glucosa en 90 ml de agua desionizada. Añadir 10 ml de la solución madre K10X. Añadir 95 l de solución de EDTA 500X. Mezclar bien. Almacenar a 4 ° C. Usar dentro de una semana.
3. Preparar fresco solución de HEPES-PSS en el día del experimento (Para 1 litro).
   1. 6,96 g NaCl, 0,35 g de KCl, 0,288 g _MgSO4 • 7H ₂ O, 0,1605 g de KH ₂ PO _4, 2,38 g de HEPES. Disolver en 100 mlagua desionizada. Marcar como frasco A.
   2. 0,312 g de CaCl ₂ • 2H ₂ O. Disolver en 100 ml de agua desionizada. Marcar como frasco B.
   3. 1,25 g de _NaHCO3, 0,991 g de glucosa. Disolver en 98 ml de agua desionizada. Marcar como frasco C.
4. Añadir 2 ml de EDTA en un matraz de 500X C. Tomar 700 ml de agua desionizada en un gran matraz. Verter el contenido del matraz A, B y C en un gran matraz con agitación continua. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.

2. Medicamentos usados

1. La fenilefrina (10 ^-2 M): Se disuelven 20,37 mg en 10 ml de agua desionizada. Alícuota de 1 ml y se almacena a -80 ° C. Diluciones seriadas para obtener 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^{-5, -6} y 10 mol / L en el día del experimento.
2. La acetilcolina (10 ^-2 M): Disolver 18,17 mg en 10 ml de agua desionizada. Alícuota de 1 ml y se almacena a -80 ° C. Diluciones seriadas para obtener 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^{-5, -6} y 10mol / L en el día del experimento.

3. Ratones

Hombre WT y sGCα ₁ ^{- / -} ratones en el fondo S6 y B6 se estudiaron a lo largo de este estudio. El sGCα ₁ ^{- / -} fueron generados como se ha descrito previamente ^4,5. Vivienda y procedimientos con animales de experimentación (ratones) fueron aprobados por el Subcomité de Investigación de Cuidado Animal del Hospital General de Massachusetts, Boston, MA.

4. Medición de la reactividad vascular en la arteria mesentérica

1. La eutanasia a los ratones con pentobarbital (200 mg / kg, ip). Abra la cavidad abdominal y diseccionar el tejido mesentérico. Aislar y disección de la arteria mesentérica de ^3er orden exenta de conjuntivo y tejido adiposo, y el lugar de la arteria en helado HEPES-PSS solución pre-equilibrio con 95% O ₂ / CO ₂ durante 15 min 5%. Cortar los anillos de 2-3 mm de longitud con ninguna ramificación de la mesentéricaarteria. La diferenciación entre las arterias y las venas en el nivel micro vasos es problemático cuando no hay sangre en los vasos. Por lo tanto, se recomienda la identificación del recipiente, mientras que todavía está intacto en el animal antes de su disección a cabo.
2. Llenar en las cánulas de vidrio en la cámara de presión myograph (DMT Modelo 110P y 11P versión 1.31, Figura 2) con una solución de HEPES-PSS con la ayuda de una jeringa de 10 ml a través de las válvulas de entrada y salida. Llenado de la cánula se debe hacer con mucho cuidado ya que la presión excesiva puede dañar el transductor frágil conectada a cánulas. Después de llenar cánulas Cierre las dos válvulas de entrada y salida con fuerza.
3. Montar un extremo del recipiente a la cánula derecho y atar cuidadosamente con una fina hebra de sutura de nylon. Con la ayuda de una jeringa, vaciar y llenar en el recipiente con una solución de HEPES a través de la válvula de entrada. Trae en la cánula izquierda más cerca de la embarcación y montar el otro extremo del recipiente en la misma. Ate con sutura de nylon. Llenarla cámara con hasta 10 ml con solución de HEPES. Compruebe si la fuga empujando suavemente solución de HEPES a través de la válvula de entrada con la ayuda de una jeringa.
4. Instalar la cámara en el miógrafo y debajo de la cámara de vídeo. Empezar el oxígeno y el calor (37 ° C) en la cámara. Conectar la válvula de entrada con el tubo P1 desde el primer depósito de solución de HEPES, mientras que la válvula está cerrada. Vamos a cualquier burbuja y solución pase a través del tubo hasta que no haya burbujas en el tubo. Abra la válvula.
5. Conecte la válvula de la izquierda de la cámara con P2 tubo procedente del regulador de presión. Una vez más comprobar que no existen burbujas. No debe haber burbujas o fugas en todo el sistema.
6. Ir al menú de presión en el panel de myo-interfaz o en el software y vuelva a conectar la bomba vez que se apaga la corriente.
7. Abra el programa y haga clic en Collect. Vessel debe ser visto en la pantalla actual (Figura 3). El recipiente se visualiza con una cámara montada en un microscopio, permitiendo Monitoring y el análisis de la luz del vaso, el diámetro del vaso, y el espesor de la pared.
8. Poco a poco aumentar la presión interluminal través de la válvula P1 seleccionando la presión P1 en el panel de myo-interfaz o en el programa y escriba el valor de la presión de la siguiente manera; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Embarcación algún momento tiende a torcer o retorcer mientras que la presión está aumentando; ajustar la tensión o la tensión de acuerdo con la ayuda de microposicionador vertical u longitudinal (Figura 2). Equilibrar el recipiente a 60 mmHg y 37 ° C al menos durante 45 min. Cambie la solución del baño una vez con HEPES precalentado durante equilibrado.
9. Aplicar 10 ml de KCl solución despolarizante, precalentado a 37 ° C, al baño para despolarizar totalmente las células del músculo liso y lograr la máxima constricción. Después de la constricción estable, enjuague el baño con una solución de HEPES 3 veces cada 10 min.
10. Comprobar la viabilidad de la embarcación y la integridad del endotelio por estable y reproducciónrespuestas ible a la adición de fenilefrina (10 ^-5 M) y la acetilcolina (10 ^-5 M). Lavar 3 veces con solución de HEPES cada 10 min.
11. Añadir fenilefrina (10 ^-5 M) para preconstrict el recipiente, y cuando se ha obtenido una constricción estable, realizar una curva de respuesta a la concentración acumulada-vasodilatación (CRC) mediante la adición secuencial de dosis crecientes de acetilcolina (10 ^-9, 3 x 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 x 10 ^-8, 10 ^-7, 3 x 10 ^{-7, -6} 10, 3 x 10 ^{-6, -5} y 10 M). Después de la última dosis, enjuague 3 veces con solución de HEPES cada 10 min antes de iniciar nueva CRC.
12. Determine el diámetro de la luz pasiva aplicando Ca ^{2 +} PSS libres que contienen EGTA 2 mM. Desde la trazados grabada medida diámetro de la luz para cada respuesta a la dosis (Figura 4), ​​que se utilizará para calcular todos los parámetros.
13. Expresar todas las respuestas de relajación acetilcolina como percentaje cambio en el diámetro del lumen después de preconstriction fenilefrina en comparación con la diferencia entre el diámetro y el diámetro libre de calcio después de la constricción fenilefrina, utilizando la siguiente ecuación:
14. Porcentaje dilatación = 100% x [(D _x - D _i) / (D _Ca-libre - D _i)], donde D es el diámetro de la luz medido y x, i, y Ca sin denotar diámetros arteriales en cada dosis de agonista (x), siguiente diámetro inicial fenilefrina constricción (i), y en el Ca ^{2 +} sin búfer (Ca-libre).

5. Análisis estadístico

Todas las mediciones continuas se expresan como media ± SEM. La reactividad vascular en arterias mesentéricas se analiza mediante medidas repetidas ANOVA de dos vías. En todos los casos, P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

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Resultados

NO está implicado en el centro de mantenimiento de la homeostasis de la presión sanguínea tanto en los seres humanos ⁶ y ⁷ en modelos animales. La capacidad de NO para controlar la relajación del músculo liso vascular está mediada por la guanilato ciclasa soluble (GCs), una enzima que contiene hemo heterodimérica que genera GMPc ^8. Recientemente, un modificador de la presión de la sangre variante genética se identificó en un locus que contiene el sGCα ₁ y los genes ...

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Discusión

Los ratones son el modelo experimental de elección para muchos investigadores, en parte debido a la posibilidad de introducir modificaciones genéticas, generando de esta manera los modelos de ratón para la fisiopatología humana. El estado vasoactivo de pequeña resistencia, pero no de grandes vasos de conducción define en gran medida la regulación del flujo de sangre a través del sistema vascular ^11. El tamaño de las arterias de resistencia en animales pequeños, tales como ratones, se evita el uso de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT