呼吸爆发的响应为先天免疫健康的斑马鱼中的指标量化

摘要

先天免疫反应保护免受病原体感染的生物体。先天免疫反应的一个重要组成部分，吞噬细胞呼吸爆发，产生活性氧杀死入侵的微生物。我们描述了量化时所产生的先天免疫反应的化学诱导的活性氧呼吸爆发测定。

摘要

吞噬细胞呼吸爆发是对病原体感染的先天免疫应答的一部分，并涉及生产活性氧（ROS）。 ROS是有毒和功能，吞噬杀灭微生物。巨噬细胞源性活性氧在体内定量分析提供了关于生物体的挂载一个强大的先天免疫反应的能力的信息。在这里，我们描述了一个协议，在化学诱导的巨噬细胞呼吸爆发的整个斑马鱼胚胎量化和比较活性氧。这种方法使得这成为经氧化活性氧荧光无荧光化合物的用途。个人斑马鱼胚胎移入微孔板的孔中并孵育在此荧光底物有或没有呼吸爆发的化学诱导剂。荧光在各孔用酶标仪定量在期望的时间点。荧光读数调整到消除背景荧光，然后合作mpared使用非配对t检验。这种方法允许对斑马鱼胚胎在不同发育阶段以及响应于实验操作，如蛋白质敲低过表达，或与药理学药剂治疗的呼吸爆发潜力的比较。此方法也可用于监测从成年斑马鱼的肾脏和其他一些鱼类物种整个剖分肾脏或细胞制剂的呼吸爆发的反应。我们认为，这一协议的相对简单性和适应性将补充现有的协议，将感兴趣的研究人员谁寻求更好地理解先天免疫反应。

引言

免疫系统是由两个分支：先天免疫和适应性免疫。先天性免疫是进化上比适应性免疫更古老。无脊椎动物是目前认为有只先天免疫，而脊椎动物兼具先天和适应性分支。而适应性免疫赋予具体和持久的免疫力，某些病原体，先天免疫是入侵的细菌，病毒和真菌立即作出反应。先天免疫反应的一个重要方面涉及的细胞因子和趋化因子的释放，从而导致炎症的巨噬细胞（ 如巨噬细胞，中性粒细胞）和招聘吞噬和破坏外来入侵者。

成功的先天免疫反应包括：（1）识别入侵微生物的;（2）感应相应的信号级联反应（ 如释放细胞因子和趋化因子）的;吞噬细胞（3）适当发展/数量充足;（4）吞噬细胞对感染部位迁移;（5）吞噬病原体;和（6）破坏吞噬微生物。在这些步骤中的任何一个A缺乏可能导致被淹没由主机，并屈服于，感染。一个强大的先天免疫反应是生物体的健康是至关重要的，因为它是抵御病原体的所有植物和动物的第一道防线。在脊椎动物中，它也可加强适应性免疫应答^1。因此，我们能够评估，以便更好地理解它，并优化它的功能的先天免疫反应的所有方面它是至关重要的。

许多模式生物用于研究先天免疫，从Arabadopsis为C。线虫到果蝇到小鼠培养的人类细胞。使用斑马鱼（ 斑马鱼 ）的模型系统来研究先天免疫系统的优点在于，斑马鱼是脊椎动物，既有先天和适应性即时通讯群落，但先天免疫和适应性免疫的发展在时间上分开。斑马鱼仅仅依靠先天免疫保护，防止感染，直到适应性免疫成为功能齐全，它发生在大约4-6周后受精^2。除了 ​​遗传操纵，光学透明性和快速，外部开发工具，先天免疫防御如在斑马鱼胚胎的原理模式提供了在其中以研究在体内的先天免疫反应的复杂性的简化模型。

多个协议已被开发，以评估在斑马鱼胚胎的先天免疫反应的不同方面。微阵列和RNAseq已经证实，通过斑马鱼先天免疫反应引起的细胞因子谱是相似于人类和也建议意想不到基因在先天免疫^3,4的参与。斑马鱼胚胎和荧光灯，transgen的透明度病原体和斑马鱼集成电路菌株允许动态宿主-病原体相互作用的体内实时可视化。转基因斑马鱼胚胎中表达绿色荧光蛋白在中性粒细胞特异性髓过氧化物酶启动子^5,6或巨噬细胞特异性启动子的mpeg1 ⁷的控制使人们有可能以可视化和量化吞噬细胞迁移到局部感染⁸的网站以及可视化吞噬和破坏荧光标记的病原体^8,9。斑马鱼的胚胎也适合进行高通量测定法和化学画面的生成。因此，最近已经开发了感染¹⁰和巨噬细胞迁移到化学诱导损伤¹¹的位点后转录组分析的高通量方法。

上面列出的技术中，没有定量评估吞噬细胞破坏病原体的最后阶段。此最后阶段涉及呼吸爆发（ 即产生的活性氧和其他有毒化合物），其中杀死吞噬病原体。酶的NADPH氧化酶是ROS在吞噬细胞的主要来源。组件的NADPH氧化酶产生的电子转移到氧亚基中，产生超氧阴离子。通过随后的酶促反应，超氧化物可以被转化成过氧化氢 ​​和次氯酸（ 图1A）。它是呼吸爆发吞噬细胞，杀死病原体，因此，斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜力的量化指标是总体先天免疫的健康。我们开发了一种基于荧光的测定法来量化在个别斑马鱼胚胎的¹²个组的呼吸爆发。这个测定法利用市售的，细胞渗透性染料的非荧光，还原形式。这种染料，2'，7'-二氯二乙酸酯（H2DCFDA），被转换成荧光％的化合物，2'，7'-二氯荧光（DCF），在氧化时。由吞噬细胞呼吸爆发产生的活性氧多样可H2DCFDA氧化并产生荧光^24。荧光的外观可以被用来量化和比较斑马鱼的组之间的呼吸爆发的反应。蛋白激酶C激动剂佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA），用于化学诱导NADPH氧化酶产生活性氧，从而提高荧光读数（ 图1B）。在此，我们提供的这个斑马鱼胚胎呼吸爆发检测的修改和优化版本的详细协议。此测定法可用于比较在一段时间和/或响应于实验操作（ 例如，吗啉代-介导的蛋白敲低）个别斑马鱼胚胎的基团之间的呼吸爆发。使用这种方法时，在与其他斑马鱼先天免疫测定法结合使用，将提供复杂和关键的更完整的图象先天免疫应答。

研究方案

1。斑马鱼的维护与保养

1. 畜牧业：质量产卵成年斑马鱼如前所述^13。收集如前所述¹⁴衍生的胚胎。
2. 显微注射（如果需要）：微导1-4细胞期斑马鱼胚胎与吗啉代寡核苷酸拦截基因产物或mRNA的过表达的基因产物，如前所述^15。
   1. 保持模拟充足池注入控制（至少48居住，模拟注入控制鱼和48的生活，实验操作的鱼来填补96孔微孔板）。
3. 维持胚胎：在卵水生长在深培养皿中胚在28℃（60μg/ ml的即时海上盐在蒸馏水中，高压灭菌），直到所需的发育阶段（使用该协议在斑马鱼胚胎呼吸爆发的反应是不可检测年龄超过2天受精后^12）。注意：它一直Øbserved，通过任一反应，用1 -苯基-2 -硫脲（PTU）或golden/slc24a5突变斑马鱼防止色素沉着在斑马鱼胚胎不显著改变荧光由PMA（未公布的数据，胚胎在48，72进行测试，和96的感应HPF）。
   1. 每天除去死胚用塑料移液管。
   2. 小心倒出旧鸡蛋水，每天补充新蛋水。
4. Dechorionate胚胎：在实验当天，dechorionate胚胎（胚胎是否仍处于绒毛膜）如先前使用（这呼吸爆发测定也可以在从成年斑马鱼¹²和肾脏详细协议解剖肾脏进行2细镊子¹⁴描述从成年斑马鱼解剖先前已经描述^16,17）。

2。溶液的制备

1. 准备H2DCFDA的储备液：称取1毫克H2DCFDA的。
   1. 迪ssolve 1毫克H2DCFDA在1ml二甲基亚砜（DMSO）中，制成1毫克/毫升的储备溶液。
   2. 使1.7 ml离心管这种原液的22微升等分。
   3. 包裹的H2DCFDA原液在铝箔分装，并保持在黑暗中只要有可能，因为H2DCFDA对光敏感。
   4. 商店H2DCFDA分装于-20℃可保存3个月。
2. 注意-准备的佛波酯（PMA）的储备液：称取1毫克的PMA使用适当的个人防护设备（ 如手套，护目镜和面罩）。
   1. 溶解PMA在1ml的DMSO中，制成1毫克/毫升的储备溶液。
   2. 使1.7 ml离心管，11微升等份。
   3. 的PMA原液在-80℃下长达3个月店等分。
3. 准备H2DCFDA的工作溶液：在实验当天，通过添加1份H2DCFDA原液1做出H2DCFDA工作溶液部分DMSO（500微克/毫升H2DCFDA最终浓度）。例如，加入20微升的H2DCFDA原液和20微升的DMSO的箔纸包裹1.7毫升离心管中。
4. 制备PMA的工作溶液：在实验当天，让一个PMA工作液中加入1份的PMA原液到49份无核酸酶的水（20微克/毫升的PMA的终浓度）。例如，稀释10μLPMA原液在490μL无核酸酶的水1.7 ml离心管。
5. 准备H2DCFDA的给药溶液：在实验当天，使用1微克/毫升H2DCFDA在蛋水的终浓度一H2DCFDA给药溶液。给药溶液的制备体积可以被修改为需要，但确保最终浓度试剂被保持。代替鸡蛋水为肾脏，用Dulbecco改良的Eagle氏medium/F-12相同体积（50％DMEM，50％的F-12，无酚红）。为了使5毫升H2DCFDA的给药溶液，用5毫升的血清吸管转移5毫升蛋水（或DMEM/F-12）到15毫升锥形离心管包裹在金属箔和标记“H”。
   1. 从15毫升锥形管标有“H”和丢弃取出10微升蛋水（或DMEM/F-12）的。
   2. 加入10μlH2DCFDA工作液到15毫升锥形管标记为'H'和旋涡混合（这个量是足够48胚胎或肾脏样本（半满96孔微孔板）和这些井将提供水平的测量结果的背景荧光）。
6. 准备H2DCFDA + PMA的给药溶液：在实验当天，请与终浓度的H2DCFDA + PMA给药溶液：H2DCFDA - 1微克/毫升和PMA - 400毫微克/毫升。为了使加入5ml H2DCFDA + PMA给药溶液，用5毫升的血清吸管转移5毫升蛋水（或DMEM/F-12）到一个新的15毫升锥形管标有“H +的P'。
   1. 删除110 _6，从15毫升锥形管标有“H +的P'和丢弃升蛋水（或DMEM/F-12）的。
   2. 加入10μlH2DCFDA工作溶液，再加入100μl的PMA工作液进15毫升锥形管中标记为“H +的P'和涡流混合（此量是足够的48个样本或一个完整的96孔微量培养板的另一半）。
7. 置于冰上计量解决方案。

3。酶标仪编程

1. 准备工具：上电酶标仪。
   1. 热身光源。
   2. 建立一个程序来读取荧光： 如激励：485纳米;发射：528纳米;光学位置：顶部510纳米;灵敏度：65，与前一个读5秒摇步。

4。 96孔微孔板设置（ 见图2）

1. 收集物资：获取菜肴dechorionated胚胎，黑色96孔微孔板，P200移液器和提示，冰桶用H2DCFDA和H2DCFDA + PMA的给药方案，多渠道P200移液器，二无菌水库，铝箔，和剪刀。
2. 转移一个胚胎到96孔微孔板的每个孔：用剪刀剪枪头，使得胚胎或肾脏适合通过开口。
   1. 设置P200移液器至100μl，并传送一个胚胎随着蛋水（或DMEM/F-12）插入尽可能多的黑色96孔微量培养板的孔中，作为理想的（没有必要改变移液管尖用于每个不同的内的实验条件下胚胎样品，但它可能有必要改变实验条件之间的提示）。一定要避免转移剩余绒毛膜，因为这些往往扭曲收集的数据。对于肾脏的转移，成交量较大移液器（设置为100微升）可以使用和移液器吸头可切割，以获得更大的口径大小，如果需要的话。可能有必要把井无胚胎或肾脏样本，但与给药方案来控制对某些实验操作。
3. 添加配料解决方案：倾H2DCFDA给药溶液到无菌25毫升水库。
   1. 使用多声道的P200移液器和八个技巧，同时吸取100微升的H2DCFDA给药溶液插入96孔微孔板（H2DCFDA 500毫微克/毫升终浓度）一列。
   2. 作为理想的（通常是六列或48口井，如果填充整个96孔微孔板）为尽可能多的列重复这个（变化的提示是没有必要的）。此溶液加至一半的控制胚胎样品和一半的实验操纵胚胎样品的（一个例子96孔微量培养板设置显示在图2中 ，这些井（着色橙色），将提供背景荧光数据中不诱导用PMA样本） 。
   3. 倒入H2DCFDA + PMA给药溶液成新，无菌25毫升水库。
   4. 使用多声道的P200移液器和八个技巧SIMULTaneously吸取100μl的H2DCFDA + PMA给药溶液到剩余的列（ 图2中显示为红色）的96孔微量培养板中（改变的提示是没有必要的，终浓度分别为H2DCFDA-500毫微克/毫升和PMA-200毫微克/毫升） 。
4. 盖上铝箔微孔板。
5. 摇动微孔板为约20秒，在150转均匀化的各溶液很好。
6. 孵育微孔板，在28℃时，它不被读取。

5。荧光定量

1. 阅读微孔板时间=使用步骤3.1.2中所述的参数加入PMA后0小时。
   1. 继续进行测量，每隔几分钟所需的时间间隔或孵化箔纸包裹微孔板在28°C，直到稍后的时间点，然后取一个端点测量在所需的时间（ 如 4小时，加入PMA后）。
2. 使用的塑料T转拨移液管来从各孔的胚胎。
3. 根据你的动物护理和使用的协议， 如浸泡在三卡因MS222安乐死的胚胎。
4. 出售中的生物危险废物容器的微孔板和其他一次性材料。

6。数据分析

1. 决定的时间点，你会在哪个喜欢比较荧光值（加PMA， 表1后如 4小时）。
2. 减去个人PMA诱导的对照组的荧光值的平均值未诱导对照组的荧光值。
3. 重复此实验组与不PMA。
4. 在两列，控+ PMA组和实验+ PMA组（ 表2）存储这些荧光强度值。
5. 计算平均值和标准偏差的控制+ PMA石斑鱼的荧光强度值p和实验+ PMA组。
6. 使用非配对t检验，以（ 表2）确定统计显着性比较归一化的荧光值。
7. 图中控+ PMA组和实验+ PMA组与误差线反映了相应的标准偏差的方法。
8. 记录的意义上的图形和在该图中说明的水平（ 图2）。

结果

这里，我们提供48比较在斑马鱼胚胎的呼吸爆发反应（野生型，AB背景）数据和72小时后的受精（HPF）。 48 HPF胚胎担任我们的对照组和72 HPF胚胎作为我们的实验组。所使用的样本量为24未诱导胚胎和24％的发育阶段PMA诱导胚胎。原始荧光读数（以相对荧光单位（RFU））被读出微量的添加PMA的4小时后获得的。在表1中提供的原始荧光值。原始荧光值始终高于在48 HPF未诱导胚胎比72 HPF未诱导?...

讨论

吞噬细胞的主要功能是检测，吞噬和消灭病原体。吞噬细胞，以产生足够的呼​​吸爆发的能力是此功能是至关重要的。因此，呼吸爆发反应的量化是一种方法，允许的个人和/或响应于实验操作的组之间的一般先天免疫系统的健康和功能的比较。在这里，我们描述了一个协议来诱导，量化，并比较各个斑马鱼胚胎的组间呼吸爆发的响应。总之，PMA导致ROS的产生的酶NADPH氧化酶。这些活性氧作用于?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478