כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

Summary

התגובה החיסונית המולדת מגנה על אורגניזמים מפני זיהום הפתוגן. מרכיב קריטי של התגובה החיסונית המולדת, פרץ הנשימה תא בלען, מייצר מיני חמצן תגובתי שהורגים מיקרואורגניזמים פולשים. אנו מתארים assay פרץ נשימה שמכמת מיני חמצן תגובתי נוצרו כאשר התגובה החיסונית המולדת מושרה כימית.

Abstract

פרץ הנשימה תא בלען הוא חלק מהתגובה החיסונית המולדת לזיהום הפתוגן וכרוך בייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS הם רעילים ולתפקד כדי להרוג מיקרואורגניזמים phagocytized. בvivo כימות של ROS נגזר תא בלען מספקת מידע לגבי היכולת של האורגניזם לעלות תגובה חיסונית מולדת חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לכמת ולהשוות ROS בעוברי דג הזברה שלמים על אינדוקציה כימית של פרץ הנשימה תא בלען. שיטה זו עושה שימוש במתחם שאינו ניאון שהופך ניאון על ידי חמצון ROS. עוברי דג הזברה אישיות pipetted לתוך הבארות של microplate וטופחו בfluorogenic מצע זה עם או בלי inducer כימי של הפרץ בדרכי הנשימה. הקרינה בכל אחד גם היא לכמת בנקודות זמן רצויות באמצעות קורא microplate. קריאות הקרינה מותאמות לחסל את הקרינה רקע ולאחר מכן במשותףmpared באמצעות מבחן t מזווג. שיטה זו מאפשרת השוואה של פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחות שונים ובתגובה למניפולציות ניסיוני, כגון מציאה חלבון, ביטוי יתר, או טיפול עם סוכנים תרופתיים. גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לפקח על תגובת פרץ בדרכי הנשימה בכליות שלמות גזורות או תכשירי תא מכליות של דג הזברה מבוגר וכמה מיני דגים אחרים. אנו מאמינים כי הפשטות והתאמה היחסית של פרוטוקול זה ישלימו את הפרוטוקולים קיימים ויהיו עניין לחוקרים המבקשים להבין את התגובה החיסונית המולדת טוב יותר.

Introduction

מערכת החיסון מורכבת משני סניפים: חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. החסינות מולדת היא אבולוציונית עתיקה יותר חסינות אדפטיבית. חסרי חוליות נמצאות כיום חשבו שיש רק חסינות מולדת, בעוד שבעלי חוליות יש שני הסניפים המולדים ובעלי כושר הסתגלות. בעוד חסינות אדפטיבית מקנה חסינות ספציפית וארוכת טווח לפתוגנים מסוימים, חסינות מולדת היא תגובה מיידית לחיידקים פולשים, וירוסים ופטריות. היבט חיוני של תגובת החיסון המולדת כולל את שחרורו של ציטוקינים וכמוקינים, שגורם לדלקת וגיוס phagocytes (למשל מקרופאגים, נויטרופילים) לבלוע ולהשמיד פולשים זרים.

תגובות חיסוניים מולדים מוצלחות לערב: (1) הכרה במיקרואורגניזמים פולשים, (2) אינדוקציה של המפלים המתאימים איתות (למשל שחרורו של ציטוקינים וכמוקינים); (3) התפתחות תקינה / מספרים מספקים של תאי phagocytic; (4) הגירה של phagocytes לאתרים של זיהום; (5) היבלעות של פתוגנים, וכן (6) השמדת מיקרואורגניזמים נבלעו. מחסור בכל אחד מהשלבים הבאים עלול להוביל למארח להיות המום, ונכנע ל, הזיהום. תגובה חיסונית מולדת חזקה היא חיונית לבריאותם של אורגניזמים כי זה קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בכל הצמחים ובעלי החיים. בבעלי חוליות, זה גם מגביר את התגובה החיסונית אדפטיבית ^1. לכן, זה קריטי, כי אנחנו מסוגלים להעריך את כל ההיבטים של תגובת החיסון המולדת כדי להבין את זה טוב יותר ועל מנת לייעל את תפקודו.

אורגניזמים מודל רבים משמשים ללמוד חסינות מולדת, החל Arabadopsis לג elegans לדרוזופילה לעכברים לתאי אדם בתרבית. יתרון בשימוש במערכת מודל (Danio rerio) דג הזברה ללמוד חסינות מולדת הוא שדג הזברה היא חוליות, עם im שני המולדות אדפטיביתmunity, אך הפיתוח של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות מופרד בזמן. דג הזברה להסתמך רק על חסינות מולדת להגנה מפני זיהום עד חסינות אדפטיבית הופכת מתפקד במלואה, אשר מתרחשת לאחר סביב 4-6 שבועות הפריה ^2. בנוסף לכלים למניפולציה גנטית, בהירות אופטית והתפתחות מהירה, חיצונית, חסינות מולדת כמצב עיקרון ההגנה בעוברי דג הזברה מספקת מודל מופשט שבו ללמוד את המורכבות של תגובת החיסון המולדת in vivo.

פרוטוקולים מרובים פותחו כדי להעריך את ההיבטים שונים של התגובה החיסונית המולדת בעוברי דג הזברה. Microarrays וRNAseq אימתו כי פרופילי ציטוקינים שהושרו על ידי התגובה החיסונית המולדת דג הזברה הם דומים לזו של בני אדם וגם הציעו את מעורבותם של גנים בלתי צפויים בחסינות מולדת ^3,4. השקיפות של עובר דג הזברה וניאון, transgenזני ic של פתוגנים ודג זברה מאפשרים ויזואליזציה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן דינמיים in vivo בזמן אמת. עוברי דג הזברה מהונדסים להביע GFP תחת שליטה של אמרגן נויטרופילים הספציפיים myeloperoxidase ^5,6 או אמרגן MPEG1 מקרופאג ספציפי ⁷ הפכו אותו ניתן לחזות ולכמת הגירת תא בלען לאתרים של זיהומים מקומיים ^8, כמו גם כדי להמחיש phagocytosis והרס של כותרתו fluorescently פתוגנים ^8,9. עוברי דג הזברה גם נתונים לדור של מבחני תפוקה גבוהה והמסכים כימיים. בהתאם לכך, שיטות תפוקה גבוהה של ניתוח transcriptome על זיהום ¹⁰ והגירה תא בלען לאתרים של פגיעה כימית שגרמה ¹¹ לאחרונה פותחו.

של הטכניקות המפורטות לעיל, אף כמותית להעריך את השלב הסופי של השמדת הפתוגן ידי phagocytes. שלב סופי זהכרוך בפרץ בדרכי הנשימה (כלומר ייצור של ROS ותרכובות רעילות אחרות), אשר להרוג פתוגנים נבלעו. מונואמין NADPH האנזים הוא מקור עיקרי של ROS בתאי phagocytic. הרכבה של יחידות משנה של תוצאות אנזים מונואמין NADPH בהעברת אלקטרונים לחמצן, שהניבו אניוני סופראוקסיד. דרך תגובות אנזימטיות שלאחר מכן, סופראוקסיד אז יכול להיות מומר למי חמצן וחומצת hypochlorous (איור 1 א). זה פרץ הנשימה של phagocytes שהורג פתוגנים וכך, כימות של פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה היא מעיד על בריאות מערכת החיסון מולדת בכללותה. פיתחנו assay הקרינה מבוסס לכמת את פרץ הנשימה בקבוצות של עוברי דג הזברה בודדים ^12. assay זה מנצל בצורה לא פלורסנט, מופחתת של צבע זמין באופן מסחרי, תא חדיר. צבע זה, 2 ', diacetate 7'-dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA), מומר לנורותמתחם הסנט, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF), על חמצון. ROS המגוון שנוצר על ידי פרץ הנשימה תא בלען יכול לחמצן H2DCFDA וליצור הקרינה ^24. המראה של הקרינה יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות את תגובת פרץ בדרכי הנשימה בין קבוצות של דג הזברה. אצטט החלבון קינאז C Myristate phorbol אגוניסט (PMA) משמש כדי לגרום כימי מונואמין NADPH כדי לייצר ROS ובכך להגדיל את קריאות הקרינה (איור 1). בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של גרסה שונה והמותאמת של assay זה דג הזברה עובר הנשימה פרץ. assay זה יכול לשמש כדי להשוות את פרץ הנשימה בין קבוצות של עוברי דג הזברה בודדים לאורך זמן ו / או בתגובה למניפולציות ניסיוני (מציאה חלבון למשל בתיווך morpholino). השימוש בשיטה זו, בשילוב עם מבחני חסינות אחרים דג הזברה מולדים, תספק תמונה של מורכב וקריטי שלמה יותרתגובה חיסונית מולדת.

Protocol

1. טיפול ותחזוקה של דג הזברה

1. בעלי: דג הזברה מבוגר שרצים המוני כפי שתוארו קודם לכן ^13. איסוף עובר הוליד כמתואר ¹⁴ בעבר.
2. Microinjection (אם רוצה): עוברי Microinject 1-4 שלב תא דג הזברה עם oligonucleotides morpholino למציאת מוצרי גן או mRNA לביטוי יתר מוצרי גן כפי שתוארו לעיל ^15.
   1. לשמור על בריכה נאותה של בקרות מדומה מוזרקת (לפחות 48 חיים, מדומה הזריק דגי שליטה ו48 חיים, יש צורך בדגי מניפולציות בניסוי למלא microplate 96 היטב).
3. לשמור על עוברים: לגדול עוברים בצלחות פטרי עמוקים על 28 מעלות צלזיוס במי ביצה (אוקיינוס ​​ים המלח מיידי 60 מיקרוגרם / מ"ל ​​במזוקק-autoclaved מים) עד לשלב ההתפתחותי הרצוי (תגובת פרץ בדרכי הנשימה היא לא ניתן לגילוי שימוש בפרוטוקול זה בעוברי דג הזברה צעיר מ2 ימים לאחר הפריה ^12). הערה: זה כבר observed כי מניעת פיגמנטציה בעוברי דג הזברה או דרך השימוש של 1-2-פניל thiourea (PTU) או דג הזברה המוטציה golden/slc24a5 אינו משנה את האינדוקציה של הקרינה על ידי PMA (נתונים שלא פורסמו, עוברים שנבדקו ב48, 72, ו96 באופן משמעותי hpf).
   1. הסר את העוברים מתים מדי יום עם פיפטה העברה פלסטיק.
   2. למזוג בזהירות מים ביצה ישנות ולחדש עם מים ביצה חדשים מדי יום.
4. עוברי Dechorionate: ביום של הניסוי, עובר dechorionate (אם עוברים עדיין בchorions) כפי שתוארו לעיל באמצעות שני מלקחיים בסדר ¹⁴ (assay פרץ נשימה זה יכול גם להתבצע על כליות גזורים מן דג הזברה מבוגר ¹² ופרוטוקולים מפורטים לכליות נתיחה מדג הזברה מבוגר תוארו בעבר ^16,17).

2. פתרון הכנה

1. הכן פתרון מניות של H2DCFDA: לשקול את 1 מ"ג של H2DCFDA.
   1. דימ"ג ssolve 1 של H2DCFDA ב 1 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO) כדי להפוך 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות.
   2. הפוך 22 aliquots μl של פתרון מניות זה ב1.7 מיליליטר microcentrifuge צינורות.
   3. עטוף את aliquots של פתרון מניות H2DCFDA בנייר אלומיניום ולשמור בחושך בכל הזדמנות אפשרית, כי H2DCFDA הוא רגיש לאור.
   4. aliquots החנות H2DCFDA ב -20 ° C עד 3 חודשים.
2. זהירות - הכן פתרון מניות של אצטט Myristate phorbol (PMA): לשקול את 1 מ"ג של PMA תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים (כלומר, כפפות, משקפי מגן ומסכה).
   1. ממיסים PMA ב 1 מיליליטר של DMSO לעשות 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות.
   2. הפוך 11 aliquots μl ב1.7 מיליליטר microcentrifuge צינורות.
   3. aliquots חנות של פתרון מניות PMA ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
3. הכן פתרון עבודה של H2DCFDA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון עובד H2DCFDA על ידי הוספת פתרון מניות H2DCFDA חלק 1 עד 1DMSO חלק (500 מיקרוגרם / מיליליטר H2DCFDA ריכוז סופי). לדוגמא, להוסיף 20 μl של פתרון מניות H2DCFDA ו20 DMSO μl לנייר כסף עטוף 1.7 מיליליטר צינור microcentrifuge.
4. הכן פתרון עבודה של PMA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון עובד PMA על ידי הוספת פתרון מניות PMA חלק 1 ל49 חלקים nuclease מים חופשיים (20 מיקרוגרם / מיליליטר PMA ריכוז סופי). לדוגמא, לדלל 10 פתרון מניות PMA μl במי nuclease ללא μl 490 בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge.
5. הכן פתרון מינון של H2DCFDA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון מינון H2DCFDA עם ריכוז סופי של מיקרוגרם / מיליליטר H2DCFDA 1 במי ביצה. הכרכים מוכנים של פתרונות המינון ניתן לשנות כרצונכם, אך להבטיח כי הריכוזים הסופיים של חומרים כימיים נשמרים. לכליות, במקום מים ביצה, להשתמש באותו הנפח של medium/F-12 שונה Dulbecco של הנשר (50% DMEM, 50% F-12, ללא פנול אדום). כדי להפוך 5 מיליליטר של H2DCFDAמינון פתרון, להשתמש פיפטה 5 מיליליטר סרולוגיות להעביר 5 מיליליטר של מים ביצה (או DMEM/F-12) ל15 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי עטוף בנייר כסף ושכותרתו "H".
   1. הסר 10 μl מים ביצה (או DMEM/F-12) מהמ"ל 15 צינור חרוטי שכותרתו 'H' וזורקים.
   2. הוסף 10 μl של פתרון עובד H2DCFDA לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר שכותרתו "H" ומערבולת לערבב (נפח זה מספיק ל48 עובר או דוגמאות כליות (מחצית microplate היטב 96) ובארות אלה יספקו מדידות של הרמה של הקרינה רקע).
6. הכן פתרון מינון של H2DCFDA + PMA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון H2DCFDA + PMA מינון עם ריכוזים סופיים של: H2DCFDA - 1 מיקרוגרם / מיליליטר ו PMA - 400 ng / ml. כדי להפוך 5 מיליליטר של תמיסת מינון H2DCFDA + PMA, השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מיליליטר להעביר 5 מיליליטר של מים ביצה (או DMEM/F-12) לתוך צינור חרוטי חדש 15 מיליליטר שכותרתו "H + P '.
   1. הסר 110 _6; ליטר של מים ביצה (או DMEM/F-12) מהמ"ל 15 צינור חרוטי שכותרתו 'P + H' וזורקים.
   2. הוסף 10 μl של פתרון עובד H2DCFDA, ואז להוסיף לפתרון עובד PMA 100 μl לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר שכותרתו 'P + H' ומערבולת לערבב (נפח זה מספיק ל48 דוגמאות או את החצי השני של microplate היטב 96 ).
7. שמור את פתרונות מינון על קרח.

3. תכנות Reader Microplate

1. הכן את מכשיר: כוח על קורא microplate.
   1. לחמם את מקור האור.
   2. הגדר את תכנית לקריאת הקרינה: למשל עירור: 485 ננומטר; פליטה: 528 ננומטר; תפקיד אופטיקה: עליון 510 ננומטר; רגישות: 65, בצעד רועד 5 שניות לפני הקריאה.

4. 96 ובכן Microplate הגדרה (ראה איור 2)

1. לאסוף מצרכים: השג מנות עם עוברי dechorionated, microplate גם שחור 96, pipettor p200 וטיפים, דלי קרח עם H2DCFDA ופתרונות מינון H2DCFDA + PMA, pipettor p200 רבת ערוצים, שני מאגרי סטרילי, רדיד אלומיניום, ומספריים.
2. עובר העברה אחד לבאר כל microplate 96 גם: מספריים השתמשו כדי לחתוך קצה פיפטה כך שעוברים או כליות כושר דרך הפתח.
   1. הגדר pipettor p200 100 μl ולהעביר עובר אחד יחד עם מים ביצה (או DMEM/F-12) לכמה שיותר מהבארות של microplate גם שחור 96 כרצוי (אין צורך לשנות את קצה פיפטה לכל אחד שונה מדגם עובר בתוך תנאי ניסוי, אבל ייתכן שיהיה צורך לשנות את הטיפים בין תנאי ניסוי). הקפד להימנע מהעברת chorions שייר, כמו אלה נוטים להטות את הנתונים שנאספו. להעברת כליות, pipettor גדולה נפח (מוגדרת 100 μl) יכולה לשמש וניתן לחתוך טיפים פיפטה כדי להשיג גודל שעמם גדול יותר, במידת צורך. ייתכן שיהיה צורך לשלב את הבארות ללא דגימות עובר או בכליות, אבל עםפתרונות מינון כדי לשלוט על כמה מניפולציות ניסיוני.
3. הוספת פתרונות מינון: יוצקים פתרון מינון H2DCFDA לתוך מאגר 25 מיליליטר סטרילי.
   1. השתמש pipettor p200 רבת ערוצים ושמונה טיפים לפיפטה בו זמנית מפתרון מינון H2DCFDA 100 μl לעמודה אחת בmicroplate 96 היטב (500 ריכוז ng / ml הסופי של H2DCFDA).
   2. חזור על פעולה זו (שינוי טיפים לא הכרחי) לעמודים רבים ככל רצוי (בדרך כלל שישה עמודים או 48 בארות אם מילוי microplate 96 גם כולו). הוספת פתרון זה למחצית מהדגימות עובר השליטה ומחצית מהדגימות עובר המניפולציה ניסויית (96 microplate גם דוגמא להגדיר מוצגת באיור 2, בארות אלה (בצבע כתום) יספק נתונים הקרינה רקע בדגימות אינן מושרה עם PMA) .
   3. יוצקים את פתרון מינון H2DCFDA + PMA לתוך מאגר 25 מיליליטר חדש, סטרילי.
   4. השתמש pipettor p200 רבת ערוצים ושמונה טיפים לsimultaneously פיפטה של פתרון מינון H2DCFDA + PMA 100 μl למדורים הנותרים (בצבע אדום באיור 2) של microplate 96 היטב (משתנה טיפים הוא לא הכרחי, ריכוזים סופיים של ng H2DCFDA-500 / מיליליטר וPMA-200 ng / ml) .
4. כסה microplate ברדיד אלומיניום.
5. נער את microplate כ 20 שניות ב150 סל"ד homogenize פתרונות בכל טוב.
6. דגירה microplate ב28 מעלות צלזיוס כאשר הוא לא להיות לקרוא.

5. כימות הקרינה

1. קרא microplate בזמן = 0 שעות לאחר התוספת של PMA באמצעות הפרמטרים שתוארו בשלב 3.1.2.
   1. תמשיך במדידות בכל כמה דקות למרווח הזמן הרצוי או דגירה microplate העטוף בנייר האלומיניום ב28 מעלות צלזיוס עד לנקודת זמן מאוחרת יותר, ולאחר מכן לקחת את מדידת נקודת סיום בזמן רצוי (לדוגמא: 4 שעות לאחר התוספת של PMA).
2. השתמש לא פלסטיקפיפטה ransfer כדי לאחזר את העוברים מהבארות.
3. להרדים את העוברים לפי הטיפול שלך בבעלי החיים ופרוטוקול שימוש, למשל הטבילה בMS222 tricaine.
4. השלך את microplate וחומרים חד פעמי אחרים במכל הפסולת הביולוגי המסוכן.

6. ניתוח נתונים

1. החלט על נקודת הזמן שבה אתה רוצה להשוות ערכי הקרינה (למשל 4 שעות לאחר התוספת של PMA, טבלת 1).
2. לחסר ערך הקרינה של קבוצת ביקורת בלתי המושרית הממוצעת מערכי הקרינה של קבוצת הביקורת המושרית PMA הבודד.
3. חזור על פעולה זו עבור קבוצת הניסוי עם ובלי PMA.
4. אחסן את ערכי הקרינה מנורמלים אלה בשני טורים, השליטה + קבוצת PMA וקבוצת הניסוי + PMA (טבלת 2).
5. חשב את הממוצעים וסטיות תקן לערכי הקרינה מנורמלים של השליטה + grou PMAp וקבוצת PMA + הניסיונית.
6. השווה את ערכי הקרינה מנורמלים באמצעות מבחן t מזווג כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות (טבלה 2).
7. גרף אמצעי השליטה + קבוצת PMA וקבוצת הניסוי + PMA עם ברים שגיאה המשקפים את סטיות התקן המתאימות.
8. רשום את רמת המובהקות בגרף ובאגדת הדמות (איור 2).

תוצאות

כאן, אנו מספקים 72 שעות שלאחר הפריה (hpf) נתונים המשווים את תגובת דרכי הנשימה פרץ בעוברי דג הזברה (wild-type, רקע א.ב.) ב48 ו. 48 עוברי hpf שימשו כקבוצת הביקורת שלנו ו72 hpf העוברים כקבוצת הניסוי שלנו. גודל המדגם השתמש היה 24 עוברים הנגרמים האו"ם ו24 עוברים הנגרמים PMA לשלב ההתפתחותי. ק?...

Discussion

התפקיד העיקרי של phagocytes הוא לזהות, לבלוע ולהשמיד פתוגנים. היכולת של phagocytes לייצר פרץ נשימה נאות היא קריטית עבור פונקציה זו. לפיכך, כימות של תגובת פרץ בדרכי הנשימה היא שיטה אחת כדי לאפשר השוואה של בריאות כללית מולדת חיסונית ותפקוד בין קבוצות של יחידים ו / או בתגובה למניפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478