ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

要約

自然免疫応答は、病原体感染に対する生物を保護します。自然免疫応答の重要な構成要素は、食細胞の呼吸バーストは、侵入する微生物を殺す活性酸素種を生成します。我々は、先天性免疫応答が化学的に誘発されたときに生成される活性酸素種を定量化する呼吸バーストアッセイを記載している。

要約

食細胞の呼吸バーストは病原体感染に対する自然免疫応答の一部であり、活性酸素種（ROS）の産生を伴う。 ROSは毒性があり、食作用を受けた微生物を死滅させるように機能する。食細胞由来のROSのインビボ定量は堅牢な自然免疫応答をマウントする生物の能力に関する情報を提供する。ここでは、食細胞の呼吸バーストの化学誘導時に全体のゼブラフィッシュ胚におけるROSを定量化し、比較するためのプロトコルを記述します。この方法は、ROSによる酸化の際に蛍光性となる非蛍光化合物を利用する。個々のゼブラフィッシュ胚は、マイクロプレートのウェルにピペットおよび呼吸バーストの化学誘導物質の有無にかかわらず、この蛍光性基質中でインキュベートする。各ウェルの蛍光をマイクロプレートリーダーを用いて、所望の時点で定量化される。蛍光読み取りは、バックグラウンド蛍光を除去するように調整され、次いで同時対応のないt検定を使用してmpared。この方法は、異なる発達段階で、そのようなタンパク質のノックダウン、過剰発現、あるいは薬理学的薬剤を用いた治療などの実験操作に応答したゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストの可能性を比較することができます。この方法はまた、成体ゼブラフィッシュの腎臓および他のいくつかの魚種からの全解剖腎臓または細胞調製物中の呼吸バースト応答をモニターするために使用することができる。私たちは、このプロトコルの相対的なシンプルさと適応性は、既存のプロトコルを補完し、より良い自然免疫応答を理解しようと研究者を対象としています信じています。

概要

先天性および適応免疫：免疫システムは、2つのブランチで構成されている。自然免疫は、進化的に適応免疫よりも古代のです。脊椎動物は、先天性および適応ブランチの両方を有するのに対し、無脊椎動物は、現在、唯一の自然免疫を有すると考えられている。適応免疫は、特定の病原体に特異的かつ長期的な免疫を付与しながら、先天性免疫は、細菌、ウイルス、および真菌の侵入に対する即時応答である。自然免疫応答の重要な側面は、外国の侵略者を巻き込むと破壊する食細胞（ 例えば 、マクロファージ、好中球）の炎症と採用になりサイトカインやケモカインの放出を伴う。

成功した自然免疫応答が関与：侵入する微生物の（1）認識、適切なシグナル伝達カスケード（サイトカインおよびケモカインの例リリース）の（2）の誘導、食細胞の（3）適切な発達/十分な数、（4）感染の部位への食細胞の遊走、病原体（5）を飲み込み、そして微生物の貪食（6）の破壊。これらのステップのいずれか1の欠乏は圧倒されたホストにつながる、感染に屈する可能性があります。それはすべての植物や動物の病原体に対する防御の最前線であるため、堅牢な自然免疫応答は、生物の健康に不可欠です。脊椎動物では、それはまた、適応免疫応答^を増強する^1。そのため、我々はそれをよりよく理解し、その機能を最適化するために、自然免疫応答のすべての側面を評価することができることが重要です。

多くのモデル生物は、 アラビドプシスから℃の範囲、自然免疫の研究に使用されている培養したヒト細胞へのマウスにショウジョウバエの虫 。自然免疫の研究にゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデルシステムを使用する利点は、ゼブラフィッシュは、先天性および適応の両方のIMで、脊椎動物であるということですmunity、まだ自然免疫と獲得免疫の開発が一時的に分離されています。適応免疫は約4〜6週間の受精後^2を発生する、完全に機能するようになるまでのゼブラフィッシュは、単に感染に対する防御のための自然免疫に依存しています。遺伝子操作、光学的透明性と迅速な、外部の開発のためのツールに加えて、ゼブラフィッシュ胚における守備の原則モードなどの自然免疫は、 生体内での自然免疫応答の複雑さを研究するする単純化したモデルが用意されています。

複数のプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚における先天性免疫応答の異なるファセットを評価するために開発されてきた。マイクロアレイおよびRNAseqは、ゼブラフィッシュ自然免疫応答によって誘発されるサイトカインプロフィールがヒトのものと同様であり、また、先天性免疫^3,4の予想外の遺伝子の関与が示唆されていることを検証しています。ゼブラフィッシュ胚および蛍光の透明性、トランスジーン病原体およびゼブラフィッシュのIC株は、リアルタイムで、生体内で動的な宿主-病原体相互作用の可視化を可能にします。好中球特有のミエロプロモーター ^5,6またはマクロファージ特異的MPEG1プロモーター ⁷の制御下にGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚は、食作用および破壊を視覚化するために局所的な感染症の⁸と同様の部位への食細胞の遊走を可視化し、定量化することが可能になってきた蛍光標識された病原体^8,9。ゼブラフィッシュ胚はまた、ハイスループットアッセイおよび化学スクリーンの生成に適している。従って、感染¹⁰と化学的に誘発される損傷の部位¹¹に食細胞の移行の際にトランスクリプトーム解析のハイスループット法が最近開発されている。

上記の技術のうち、どれも定量的に食細胞による病原体の破壊の最終段階を評価しません。この最終段階飲み込ま病原体を殺す呼吸バースト（ すなわち 、ROSの生産および他の毒性化合物）を伴う。酵素NADPHオキシダーゼは、食細胞内ROSの主要な源である。酸素への電子の伝達におけるNADPHオキシダーゼ酵素結果のサブユニットのアセンブリー、スーパーオキシドアニオンを生成する。その後の酵素反応を介して、スーパーオキシドは、その後過酸化水素および次亜塩素酸（ 図1A）に変換することができる。これは、病原体を殺すため、ゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストの可能性の定量化は、全体的な自然免疫の健康の指標である食細胞の呼吸バーストです。私たちは、個々のゼブラフィッシュ胚¹²のグループで呼吸バーストを定量化するための蛍光ベースのアッセイを開発しました。このアッセイは、市販の、細胞浸透性色素の非蛍光、還元体を利用する。この色素は、2 '、7'-ジクロロジアセテート（H2DCFDA）は、fluoresに変換される酸化時セント化合物、2 '、7'-ジクロロフルオレセイン（DCF）。食細胞呼吸バーストによって生成された多様なROSがH2DCFDAを酸化し、蛍光^24を生成することができます。蛍光の出現は、ゼブラフィッシュのグループ間の呼吸バースト応答を定量化し、比較することができる。プロテインキナーゼCアゴニストホルボールミリステートアセテート（PMA）は、化学的にROSを生成するNADPHオキシダーゼを誘導し、従って、蛍光読み取り（ 図1B）を増加させるために使用される。ここに、我々は、このゼブラフィッシュ胚呼吸バーストアッセイの修正と最適化されたバージョンの詳細なプロトコルを提供する。このアッセイは、経時的および/ ​​または実験操作（ 例えば、モルホリノ媒介性タンパク質ノックダウン）に応答して、個々のゼブラフィッシュ胚の呼吸バースト群間を比較するために使用することができる。この方法の使用は、他のゼブラフィッシュ先天性免疫アッセイと連動して、複雑で重要なのより完全な像を提供する先天性免疫応答。

プロトコル

1。ゼブラフィッシュケアとメンテナンス

1. 畜産：マススポーン大人のゼブラフィッシュは、以前に^13を説明した。以前に^14を説明したように生成された胚を収集します。
2. マイクロインジェクション（必要な場合）：ホリノオリゴヌクレオチドを用いたマイクロインジェクション1-4細胞期のゼブラフィッシュ胚以前に^15を説明するように遺伝子産物を過剰発現するように遺伝子産物またはmRNAをノックダウンする。
   1. モックの十分なプールを維持するには、コントロールを注入された（少なくとも48の生活、モックが実験的に操作魚が96ウェルマイクロプレートを埋めるために必要とされる、コントロールの魚と48の生活に注射）。
3. 胚を維持：卵の水に28℃で、深いペトリ皿の中の胚を育てる目的の発達段階（呼吸バースト応答はゼブラフィッシュ胚でこのプロトコルを使用して検出可能でなくなるまで（60μg/ mlのインスタントオーシャンシーソルト水オートクレーブ蒸留）より若い2日）は受精^12を投稿してください。注：は、Oでした1 -フェニル-2 -チオ尿素の使用（PTU）のいずれかを介してゼブラフィッシュ胚における色 ​​素沈着を予防またはgolden/slc24a5変異体ゼブラフィッシュが大幅にPMA（未発表データ、48でテスト胚、72、および96によって蛍光の誘導を変化させないことをbserved HPF）。
   1. プラスチックホールピペットで毎日死んで胚を削除します。
   2. 慎重に古い卵の水をデカントし、毎日新しい卵の水で補給してください。
4. 実験当日、dechorionate胚（胚は彼らの絨毛膜に残っている場合）以前に2細かい鉗子^14を用いて説明したように（この呼吸バーストアッセイはまた、腎臓のための大人のゼブラフィッシュ¹²および詳細なプロトコルから解剖腎臓に実行できます。Dechorionate胚大人のゼブラフィッシュからの解剖は、以前^）16,17に記載されている。

2。溶液の調製

1. H2DCFDAの原液を準備します。H2DCFDA 1mgを秤量。
   1. ディ1 mg / mlのストック溶液を作るためにジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中のH2DCFDAのssolve 1ミリグラム。
   2. 1.7ミリリットルマイクロ遠心管中でこの原液22μlのアリコートを作る。
   3. アルミ箔でH2DCFDA原液の一定分量をラップし、H2DCFDAは感光性であるため、暗い可能な限りおいてください。
   4. 最大3ヶ月間-20℃で保存H2DCFDA分量。
2. 注意-ホルボールミリステートアセテート（PMA）の原液を準備し、適切な個人用保護具（ すなわち 、手袋、ゴーグルとマスク）を使用して、PMA 1mgを秤量。
   1. 1 mg / mlのストック溶液を作るためにDMSO 1ml中にPMAを溶解する。
   2. 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに11μLずつを加えます。
   3. 最大3ヶ月間-80℃でのPMA原液の店舗ずつ。
3. H2DCFDAのワーキング溶液を調製します。実験の日に、1に1部H2DCFDA原液を添加することにより、H2DCFDAワーキング溶液を作る部品のDMSO（500μg/ mlのH2DCFDA最終濃度）。例えば、H2DCFDAストック溶液20μlを追加し、ホイルに20μlのDMSOを1.7 mlマイクロチューブを包んだ。
4. PMAのワーキング溶液を調製：実験の日に、49の部分に、ヌクレアーゼフリーの水を1部、PMAのストック溶液を添加することによって、PMA作業溶液を作る（20μg/ mlのPMA最終濃度）。例えば、1.7ミリリットルのマイクロチューブに490μlのヌクレアーゼフリーの水で10μlのPMA原液を希釈。
5. H2DCFDAの投与溶液の調製：実験の日に、卵の水に1μg/ mlのH2DCFDAの最終濃度でH2DCFDAの投与溶液を作る。投与溶液の調製容積は、所望のように変更したが、試薬の最終濃度が維持されていることを確認することができる。腎臓の場合は、代わりに卵の水、（フェノールレッドなしで、50％のDMEM、50％のF-12）ダルベッコ改変イーグルmedium/F-12の同じボリュームを使用しています。 H2DCFDAの5ミリリットルを作成するには解決策を投与、コニカル遠心管をホイルで包み、 'H'とラベル15ミリリットルに5卵mlの水（またはDMEM/F-12）を転送するために5ミリリットル血清学的ピペットを使用しています。
   1. 15ミリリットルから10卵の水の液（またはDMEM/F-12）を削除 'H'とラベル円錐管、廃棄します。
   2. （このボリュームは48胚または腎臓サンプル（全96ウェルマイクロプレートの半分のために十分である）混合する「H」とボルテックスラベル15ミリリットルコニカルチューブにH2DCFDA作業液10μlを追加し、これらのウェルは、レベルの測定を提供します）バックグラウンド蛍光の。
6. 実験の日に、最終濃度でH2DCFDA + PMAの投与溶液行います：H2DCFDA + PMAの投与溶液を準備しH2DCFDAを - 1μg/ mlのとPMA - 400 ng / mlの。 H2DCFDA + PMA投与溶液5mlを加えるには、「H + P」という新しい15ミリリットルコニカルチューブに卵、水（またはDMEM/F-12）の5ミリリットルを転送するために5ミリリットル血清学的ピペットを使用しています。
   1. _ 110を削除する6; 'H + P」とラベル15ミリリットルから卵、水（またはDMEM/F-12）のL円錐管、廃棄します。
   2. 、H2DCFDAワーキング溶液10μlを追加 'H + P」とラベル付けされ、その後15ミリリットルに、PMA作業溶液100μlを加え円錐管と混合する渦（このボリュームは、48サンプルまたは完全な96ウェルマイクロプレートの他の半分のために十分である）。
7. 氷上の投与溶液を保管してください。

3。マイクロプレートリーダープログラミング

1. マイクロプレートリーダーの電源をオンにします。楽器を準備します。
   1. 光源のウォームアップ。
   2. 蛍光読み込むプログラムが設定しますが例えば励起：485 nmの、放射：528 nmの、光学位置：トップ510ナノメートル、感度：65、先読みにステップを振っ5秒で。

4。 96穴マイクロプレートのセットアップ（ 図2を参照）

1. 消耗品を収集します。絨毛膜を除去した胚と皿、黒の96ウェルマイクロプレート、P200ピペッターとを取得ヒント、H2DCFDAおよびH2DCFDA + PMA投与溶液、マルチチャンネルP200ピペッター、2無菌貯水池、アルミニウム箔およびはさみでアイスバケット。
2. 96穴マイクロプレートの各ウェルに転送1胚：使用はさみピペットチップをカットするように開口部を通って適合する胚または腎臓。
   1. 必要に応じて（それは各々が異なるため、ピペットチップを変更する必要はありません100μlにP200ピペッターを設定し、黒の96ウェルマイクロプレートのウェルのような多くに卵、水（またはDMEM/F-12）と一緒に1胚を転送胚の実験条件内のサンプルが、これは実験条件間でチップを交換する必要があるかもしれない）。これらは、収集されたデータをゆがめる傾向があるので、残留絨毛膜を転送しないようにしてください。腎臓の転送のために、（100μlに設定された）大きな体積ピペッターを使用することができ、必要に応じてピペットチップは、より大きな孔サイズを得るために切断することができる。これは、胚または腎臓試料なしでウェルを組み込むことが必要であるが、有することができるいくつかの実験操作を制御するために投与溶液。
3. 投与溶液を追加し、滅菌25ミリリットルリザーバーにH2DCFDAの投与溶液を注ぐ。
   1. 同時に96ウェルマイクロプレート（H2DCFDAの500 ng / mlの最終濃度）に1列にH2DCFDA投与溶液100μlをピペットするためにマルチチャンネルP200ピペッターおよび8のヒントを参考にしてください。
   2. （全体の96穴マイクロプレートを充填した場合、通常は6列または48ウェルの）必要な数の列に対して、この（TIPSの変更が必要ありません）を繰り返します。対照胚サンプルと実験的に操作胚サンプルの半分は半分にこのソリューションを追加します（例：96ウェルマイクロプレートを設定し、図2に示されている、これらのウェル（オレンジ色）、PMAで誘導していない試料では、バックグラウンド蛍光データを提供します） 。
   3. 新しい滅菌25ミリリットルリザーバーにH2DCFDA + PMAの投与溶液を注ぐ。
   4. simultするマルチチャンネルP200ピペッターおよび8のヒントを参考にしてくださいaneously（、ヒントを変更することは必要ありませんミリリットルH2DCFDA-500 NG /およびPMA-200 ng / mlの最終濃度）を96ウェルマイクロプレートの残りの列（ 図2の赤で表示）にH2DCFDA + PMA投与溶液100μlをピペット。
4. アルミホイルでマイクロプレートをカバーしています。
5. 各ウェル内の溶液を均質化する150 rpmで約20秒間、マイクロプレートを横に振る。
6. それが読まれていないときに28℃でマイクロプレートをインキュベートする。

5。蛍光定量

1. ステップ3.1.2で説明したパラメータを使用して、PMAの添加後の時間= 0時間目に、マイクロプレートをお読みください。
   1. （PMAの添加後4時間など ）所望の時間間隔のための測定を数分おきに撮影を続行以降の時点まで、28℃でのホイル包まれたマイクロプレートをインキュベートし、目的の時点で、エンドポイントの測定を行う。
2. プラスチックtを使用するウェルから胚を取得する順伝達ピペット。
3. 、あなたの動物のケアと使用プロトコルに従ってトリカインMS222における例えば浸漬胚を安楽死させる。
4. バイオハザード廃棄物容器内のマイクロプレートや他の使い捨て材料を処分。

6。データ解析

1. あなたは、蛍光値を比較したいと思いますた時点（PMA、 表1を加えた後例えば 4時間）を決定します。
2. 個々のPMA誘導対照群の蛍光値からの平均非誘導対照群の蛍光値を引きます。
3. PMAとない実験群のためにこれを繰り返します。
4. 2列、コントロール+ PMA群と実験+ PMA群（ 表2）、これらの正規化された蛍光値を格納します。
5. コントロール+ PMA grouの正規化された蛍光値のための平均と標準偏差を計算するPと実験+のPMAグループ。
6. （ 表2）の統計的有意性を決定するために、対応のないt検定を用いて正規化された蛍光値を比較する。
7. グラフコントロール+ PMAグループと適切な標準偏差を反映してエラーバーを用いた実験+ PMAグループの手段。
8. グラフ上や図の凡例（ 図2）における有意水準を記録します。

結果

ここでは、48および72時間後に受精（HPF）でのゼブラフィッシュ胚（野生型、AB型、バックグラウンド）での呼吸バースト応答を比較するデータを提供する。 48 HPFの胚は、我々の実験群としての対照群および72 HPFの胚を務めた。使用したサンプル·サイズは24非誘導胚および発達段階ごとの24 PMA誘導胚だった。 （相対蛍光単位（RFU）で生）蛍光読み取りを4時間PMAの添加後、マイクロプレートを...

ディスカッション

食細胞の主な機能は、検出巻き込む、および病原体を破壊することである。適切な呼吸バーストを生成する食細胞の能力は、この機能のために重要である。したがって、呼吸バースト応答の定量化は、個体群間および/または実験操作に応答して一般的な先天性免疫の健康および機能の比較を可能にする一つの方法である。ここでは、誘導し、定量化、および個々のゼブラフィッシュ胚のグル...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478