Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

Riepilogo

La risposta immunitaria innata protegge contro l'infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell'ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell'ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente.

Abstract

Il burst respiratorio dei fagociti è parte della risposta immunitaria innata all'infezione patogeno e comporta la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). ROS sono tossici e la funzione di uccidere i microrganismi fagocitati. In vivo quantificazione dei fagociti di derivazione ROS fornisce informazioni per quanto riguarda la capacità di un organismo di montare una risposta immunitaria innata robusto. Qui si descrive un protocollo per quantificare e confrontare i ROS in interi embrioni di zebrafish dopo induzione chimica del burst respiratorio dei fagociti. Questo metodo fa uso di un composto non fluorescente che diventa fluorescente durante l'ossidazione da ROS. I singoli embrioni di zebrafish sono aggiunti nei pozzetti di una micropiastra e incubate in questo substrato fluorogenico con o senza un induttore chimico del burst respiratorio. Fluorescenza in ogni pozzetto è quantificato in momenti desiderati utilizzando un lettore di micropiastre. Letture di fluorescenza sono rettificati per eliminare fluorescenza di fondo e poi compared utilizzando un t-test per dati non appaiati. Questo metodo permette la comparazione del potenziale burst respiratorio di zebrafish embrioni a diversi stadi di sviluppo e in risposta a manipolazioni sperimentali come proteina smontabile, sovraespressione, o trattamento con agenti farmacologici. Questo metodo può anche essere usato per monitorare la risposta burst respiratorio in interi reni sezionato o preparazioni di cellule di rene di zebrafish adulti e alcune altre specie ittiche. Crediamo che la relativa semplicità e adattabilità di questo protocollo si integrano protocolli esistenti e sarà di interesse per i ricercatori che cercano di comprendere meglio la risposta immunitaria innata.

Introduzione

Il sistema immunitario è costituito da due rami: immunità innata e adattativa. L'immunità innata è evolutivamente più antica di immunità adattativa. Gli invertebrati sono attualmente pensa di avere solo l'immunità innata, mentre i vertebrati possiedono entrambi i rami innata e adattativa. Mentre l'immunità adattativa conferisce l'immunità specifica e di lunga durata a certi agenti patogeni, immunità innata è una risposta immediata ai batteri invasori, virus e funghi. Un aspetto cruciale della risposta immunitaria innata comporta il rilascio di citochine e chemochine, che si traduce in infiammazione e il reclutamento dei fagociti (es. macrofagi, neutrofili) per inghiottire e distruggere gli invasori stranieri.

Risposte immunitarie innate di successo riguardano: (1) il riconoscimento di microrganismi invasori, (2) induzione di cascate di segnalazione adeguati (ad esempio rilascio di citochine e chemochine), (3) lo sviluppo corretto / numero adeguato di fagociti; (4) La migrazione dei fagociti a siti di infezione; (5) fagocitazione di agenti patogeni, e (6) la distruzione dei microrganismi inghiottito. Una carenza in uno qualsiasi di questi passi potrebbe portare per l'host di essere sopraffatti da, e soccombere, l'infezione. Una risposta immunitaria innata robusta è vitale per la salute degli organismi perché è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in tutte le piante e animali. Nei vertebrati, potenzia anche la risposta immunitaria adattativa ^1. Pertanto, è fondamentale che siamo in grado di valutare tutti gli aspetti della risposta immunitaria innata per comprendere meglio e per ottimizzare la sua funzione.

Molti organismi modello sono utilizzati per studiare l'immunità innata, che vanno da Arabadopsis a C. elegans di Drosophila a topi di cellule umane in coltura. Un vantaggio di utilizzare il pesce zebra (Danio rerio) sistema modello per studiare l'immunità innata è che il zebrafish è un vertebrato, con im sia innata e adattativaComunità, ma lo sviluppo dell'immunità innata e adattativa sono temporalmente separati. Zebrafish fare affidamento esclusivamente sulle immunità innata per la protezione contro l'infezione fino a quando l'immunità adattativa diventa pienamente funzionale, che si verifica circa 4-6 settimane dopo la fecondazione ^2. Oltre agli strumenti per la manipolazione genetica, chiarezza ottica e rapido, sviluppo esterno, l'immunità innata come modalità principio di difesa in embrioni di zebrafish fornisce un modello semplificato in cui studiare la complessità della risposta immunitaria innata in vivo.

Sono stati sviluppati protocolli multipli per valutare diversi aspetti della risposta immunitaria innata in embrioni di zebrafish. Microarrays e RNAseq hanno confermato che i profili delle citochine indotte dalla risposta immunitaria innata zebrafish sono simili a quello umano e hanno anche suggerito il coinvolgimento di geni inattese immunità innata ^3,4. La trasparenza del zebrafish e fluorescenti, transgenderic ceppi di patogeni e zebrafish permettono la visualizzazione delle interazioni ospite-patogeno dinamici in vivo in tempo reale. Embrioni di zebrafish transgenici esprimenti GFP sotto il controllo del specifico neutrofili mieloperossidasi promotore ^5,6 o la specifica-macrofago MPEG1 promotore ⁷ hanno permesso di visualizzare e quantificare la migrazione dei fagociti a siti di infezioni localizzate ⁸ nonché di visualizzare fagocitosi e distruzione di fluorescente patogeni ^8,9. Embrioni di zebrafish sono anche suscettibili alla generazione di saggi high-throughput e schermi chimici. Di conseguenza, sono stati recentemente sviluppati metodi high-throughput di analisi del trascrittoma al momento dell'infezione ¹⁰ e la migrazione dei fagociti a siti di lesione indotta chimicamente ^11.

Delle tecniche sopra elencate, nessuna valutare quantitativamente la fase finale di distruzione patogeno dai fagociti. Questa fase finalecomporta un burst respiratorio (ossia la produzione di ROS e di altri composti tossici), che uccidono gli agenti patogeni inghiottito. L'enzima NADPH ossidasi è una delle principali fonti di ROS in fagociti. Assemblaggio delle subunità dei NADPH ossidasi risultati degli enzimi nel trasferimento di elettroni all'ossigeno, generando anioni superossido. Attraverso successive reazioni enzimatiche, superossido può quindi essere convertito in perossido di idrogeno e acido ipocloroso (Figura 1A). È il burst respiratorio dei fagociti che uccide i patogeni e quindi, la quantificazione del potenziale burst respiratorio di embrioni di zebrafish è indicativo della salute immunitaria innata generale. Abbiamo sviluppato un saggio basato sulla fluorescenza per quantificare il burst respiratorio in gruppi di singoli embrioni di zebrafish ^12. Questa analisi utilizza la non fluorescente, forma ridotta di un colorante cellula-permeabile disponibile in commercio. Questo colorante, 2 ', 7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA), viene convertito nelle fluorescenticomposto cent, 2 ', 7'-diclorofluoresceina (DCF), in seguito all'ossidazione. Le diverse ROS generati dal burst respiratorio dei fagociti possono ossidare H2DCFDA e generare la fluorescenza ^24. La comparsa di fluorescenza può essere utilizzato per quantificare e confrontare la risposta burst respiratorio tra gruppi di zebrafish. La proteina chinasi C acetato agonista forbolo miristato (PMA) viene usato per indurre chimicamente NADPH ossidasi per produrre ROS e quindi aumentare letture della fluorescenza (Figura 1B). Qui, forniamo un protocollo dettagliato di una versione modificata ed ottimizzata di questo zebrafish embrione respiratorio saggio burst. Questo test può essere utilizzato per confrontare il burst respiratorio tra gruppi di singoli embrioni di zebrafish nel tempo e / o in risposta a manipolazioni sperimentali (ad esempio morfolino-mediata knockdown proteine). L'utilizzo di questo metodo, in collaborazione con altri zebrafish saggi dell'immunità innata, fornirà un quadro più completo del complesso e criticorisposta immunitaria innata.

Protocollo

1. Cura e manutenzione Zebrafish

1. Zootecnica: escursione Mass adulto zebrafish come descritto in precedenza ^13. Raccogliere gli embrioni generati come descritto in precedenza ^14.
2. Microiniezione (se desiderato): microinject 1-4 della fase delle cellule di embrioni di zebrafish con oligonucleotidi morpholino al knockdown prodotti genici o mRNA per sovraesprimere prodotti genici come descritto in precedenza ^15.
   1. Mantenere una piscina adeguata di finto controlli iniettato (almeno 48 che vivono, finto iniettato pesci di controllo e 48 di vita, pesci sperimentalmente manipolato sono necessari per riempire un pozzo micropiastra 96).
3. Mantenere gli embrioni: crescere gli embrioni in capsule di Petri profonde a 28 ° C in acqua uovo (60 mg / ml Instant Ocean Sea Salt in acqua distillata-autoclavato acqua) fino alla fase di sviluppo desiderato (una risposta burst respiratorio non è rilevabile utilizzando questo protocollo in embrioni di zebrafish età inferiore ai 2 giorni dopo la fecondazione ^12). Nota: E 'stato observed che la prevenzione pigmentazione in embrioni di zebrafish sia attraverso l'utilizzo di 1-fenil 2-tiourea (PTU) o golden/slc24a5 zebrafish mutanti non altera in maniera significativa l'induzione di fluorescenza da PMA (dati non pubblicati, gli embrioni testati a 48, 72, e 96 hpf).
   1. Rimuovere gli embrioni morti al giorno con una pipetta di trasferimento di plastica.
   2. Decantare attentamente acqua uovo vecchio e riempire con acqua nuova giornaliera di uova.
4. Embrioni Dechorionate: Il giorno dell'esperimento, gli embrioni dechorionate (se gli embrioni sono ancora nelle loro chorions) come descritto in precedenza con due belle pinze ¹⁴ (questo test burst respiratorio possono essere eseguite anche sui reni sezionati da zebrafish adulto ¹² e protocolli dettagliati per i reni dissezione di zebrafish adulto sono stati precedentemente descritto ^16,17).

2. Soluzione Preparazione

1. Preparare una soluzione stock di H2DCFDA: Pesare 1 mg di H2DCFDA.
   1. Dissolve 1 mg di H2DCFDA in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per fare un / ml di soluzione 1 mg.
   2. Fai 22 microlitri aliquote di questa soluzione in 1,7 ml provette da microcentrifuga.
   3. Avvolgere le aliquote di soluzione di riserva H2DCFDA in un foglio di alluminio e conservare al buio, quando possibile, perché H2DCFDA è sensibile alla luce.
   4. Conservare H2DCFDA aliquote a -20 ° C per un massimo di 3 mesi.
2. ATTENZIONE - Preparare una soluzione madre di acetato phorbol myristate (PMA): Pesare 1 mg di PMA con un equipaggiamento di protezione individuale (es. guanti, occhiali e maschera).
   1. Sciogliere PMA in 1 ml di DMSO a fare un / ml di soluzione 1 mg.
   2. Fai 11 microlitri aliquote in 1,7 ml provette da microcentrifuga.
   3. Il negozio di aliquote di soluzione madre PMA a -80 ° C per un massimo di 3 mesi.
3. Preparare una soluzione di lavoro di H2DCFDA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione di lavoro H2DCFDA aggiungendo H2DCFDA soluzione stock 1 a 1 parteDMSO parte (500 mg / ml H2DCFDA concentrazione finale). Ad esempio, aggiungere 20 ml di soluzione stock H2DCFDA e 20 microlitri DMSO ad una lamina avvolto 1,7 ml provetta.
4. Preparare una soluzione di lavoro di PMA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione di lavoro PMA aggiungendo PMA soluzione stock 1 parte a 49 parti di acqua priva di nucleasi (20 mcg / ml PMA concentrazione finale). Ad esempio, diluire 10 ml di soluzione stock PMA in 490 microlitri acqua priva di nucleasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga.
5. Preparare una soluzione di dosaggio di H2DCFDA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione di dosaggio H2DCFDA con una concentrazione finale di 1 mg / ml in acqua H2DCFDA uovo. I volumi preparate delle soluzioni di dosaggio possono essere modificate a piacimento, ma garantiscono che le concentrazioni finali dei reagenti vengono mantenute. Per reni, al posto dell'acqua uovo, utilizzare lo stesso volume di Dulbecco modificato medium/F-12 Eagle (DMEM 50%, 50% F-12, senza rosso fenolo). Per fare 5 ml di H2DCFDAdosaggio soluzione, utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 5 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) in una provetta da 15 ml conica avvolto in carta stagnola ed etichettato 'H'.
   1. Rimuovere 10 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) dalle tubo da 15 ml etichettato 'H' e scartare.
   2. Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro H2DCFDA nel tubo da 15 ml denominato 'H' e vortex per miscelare (questo volume è sufficiente per 48 embrioni oi campioni del rene (la metà di un full 96 ben micropiastra) e questi pozzi fornirà misurazioni del livello di fluorescenza di fondo).
6. Preparare una soluzione di dosaggio di H2DCFDA + PMA: Il giorno dell'esperimento, fare una soluzione H2DCFDA + PMA dosaggio con concentrazioni finali di: H2DCFDA - 1 ug / ml e PMA - 400 ng / ml. Per fare 5 ml di soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA, utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 5 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) in un nuovo tubo da 15 ml etichettato 'H + P'.
   1. Rimuovere 110 _6; l di acqua uovo (o DMEM/F-12) dalle tubo da 15 ml etichettato 'H + P' e scartare.
   2. Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro H2DCFDA, poi aggiungere 100 ml di soluzione di lavoro PMA nel tubo da 15 ml etichettato 'H + P' e agitare per miscelare (questo volume è sufficiente per 48 campioni o l'altra metà di un pieno 96 ben micropiastra ).
7. Conservare le soluzioni di dosaggio su ghiaccio.

3. Microplate Reader Programmazione

1. Preparare strumento: Accendere il lettore di micropiastre.
   1. Riscaldare la sorgente di luce.
   2. Impostare un programma per leggere la fluorescenza: per es eccitazione: 485 nm, emissione: 528 nm; Ottica Ruolo: top 510 nm; Sensibilità: 65, con 5 sec agitazione passo prima della lettura.

4. 96 Beh Microplate Set Up (vedi figura 2)

1. Raccogliere le forniture: Ottenere i piatti con gli embrioni dechorionated, nero 96 ben micropiastra, p200 pipetta esuggerimenti, secchiello per il ghiaccio con H2DCFDA e soluzioni di dosaggio H2DCFDA + PMA, multicanale p200 pipetta, due serbatoi sterili, fogli di alluminio, e forbici.
2. Trasferimento di un embrione in ciascun pozzetto di una micropiastra da 96 pozzetti: Usare le forbici per tagliare un puntale tale che gli embrioni oi reni in forma attraverso l'apertura.
   1. Impostare una pipetta P200 a 100 microlitri e trasferire un embrione con acqua uovo (o DMEM/F-12) in quanto molti dei pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero come desiderato (non è necessario cambiare la punta della pipetta per ogni diverso campione embrione all'interno di una condizione sperimentale, ma può essere necessario cambiare gli aghi tra condizioni sperimentali). Essere sicuri di evitare di trasferire chorions residue, in quanto questi tendono a distorcere i dati raccolti. Per il trasferimento dei reni, una pipetta volume maggiore (impostato a 100 microlitri) può essere utilizzato e punte di pipetta può essere tagliato per ottenere un diametro maggiore, se necessario. Potrebbe essere necessario incorporare pozzetti senza campioni embrione o renali, ma conle soluzioni di dosaggio per il controllo di alcune manipolazioni sperimentali.
3. Aggiungere le soluzioni di dosaggio: Versare la soluzione di dosaggio H2DCFDA in una sterile 25 ml serbatoio.
   1. Utilizzare un p200 pipetta multicanale e otto suggerimenti per pipetta contemporaneamente 100 ml di soluzione di dosaggio H2DCFDA in una colonna sul pozzo micropiastra 96 ​​(500 ng concentrazione finale ml / di H2DCFDA).
   2. Ripetere questo (cambiando punte non è necessario) per il numero di colonne desiderato (di solito sei colonne o 48 pozzetti se riempire un'intera micropiastra a 96 pozzetti). Aggiungere questa soluzione alla metà dei campioni embrioni controllo e la metà dei campioni embrioni manipolati sperimentalmente (esempio 96 ben micropiastre impostato è mostrato in Figura 2, questi pozzi (colore arancione) fornirà dati di fluorescenza di fondo in campioni non indotte con PMA) .
   3. Versare la soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA in un nuovo, sterile serbatoio 25 ml.
   4. Utilizzare un p200 pipetta multicanale e otto suggerimenti per simultaneously pipetta 100 microlitri della soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA nelle restanti colonne (di colore rosso in figura 2) del pozzo micropiastra 96 (cambiando punte non è necessario, concentrazioni finali di H2DCFDA-500 ng / ml e PMA-200 ng / ml) .
4. Coprire la micropiastra con il foglio di alluminio.
5. Agitare la micropiastra per circa 20 sec a 150 rpm per omogeneizzare le soluzioni in ciascun pozzetto.
6. Incubare la micropiastra a 28 ° C quando non viene letto.

5. Fluorescenza Quantificazione

1. Leggere la micropiastra al tempo = 0 ore dopo l'aggiunta di PMA utilizzando i parametri descritti al punto 3.1.2.
   1. Continuare le misurazioni ogni pochi minuti per l'intervallo di tempo desiderato o incubare la pellicola avvolta micropiastra a 28 ° C fino a un punto secondo tempo e prendere una misura endpoint all'ora desiderata (ad esempio 4 ore dopo l'aggiunta di PMA).
2. Utilizzare una plastica transfer pipetta per recuperare gli embrioni dai pozzetti.
3. Euthanize gli embrioni in base alla vostra cura degli animali e il protocollo di utilizzo, ad esempio, l'immersione in tricaine MS222.
4. Smaltire la microplacca e altri materiali usa e getta nel contenitore rifiuti a rischio biologico.

6. Analisi dei dati

1. Decidere il punto ora in cui si desidera confrontare valori di fluorescenza (es. 4 ore dopo l'aggiunta di PMA, tabella 1).
2. Sottrarre il valore di fluorescenza del gruppo media di controllo non-indotta dai valori di fluorescenza del singolo gruppo di controllo PMA-indotta.
3. Ripetere questa operazione per il gruppo sperimentale con e senza PMA.
4. Memorizzare questi valori di fluorescenza normalizzate in due colonne, il controllo + gruppo PMA e il gruppo sperimentale + PMA (Tabella 2).
5. Calcolare le medie e le deviazioni standard per i valori di fluorescenza normalizzati del controllo + PMA Group e il gruppo + PMA sperimentale.
6. Confrontare i valori di fluorescenza normalizzati utilizzando un t-test per dati non appaiati per determinare la significatività statistica (Tabella 2).
7. Grafico i mezzi di controllo + gruppo PMA e il gruppo sperimentale + PMA con barre di errore riflettono le opportune deviazioni standard.
8. Registrare il livello di significatività sul grafico e nella figura legenda (Figura 2).

Risultati

Qui, forniamo i dati confrontando la risposta burst respiratorio in embrioni di zebrafish (wild-type, AB sfondo) a 48 e 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Le 48 embrioni HPF agito come il nostro gruppo di controllo e 72 HPF embrioni come il nostro gruppo sperimentale. La dimensione del campione utilizzato è stato di 24 embrioni non-indotta e 24 embrioni PMA-indotta per ogni fase di sviluppo. Letture della fluorescenza prime (in unità di fluorescenza relativa (RFU)) sono stati ottenuti leggendo la micropiastra 4 ore do...

Discussione

La funzione primaria di fagociti è quello di rilevare, inghiottire e distruggere gli agenti patogeni. La capacità dei fagociti di produrre un burst respiratorio adeguato è fondamentale per questa funzione. Pertanto, la quantificazione della risposta burst respiratorio è un metodo per permettere il confronto di salute generale e la funzione immunitaria innata tra gruppi di individui e / o in risposta a manipolazioni sperimentali. Qui, descriviamo un protocollo per indurre, quantificare e confrontare la risposta burst...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478