Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

Resumo

A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente.

Resumo

A explosão respiratória dos fagócitos é parte da resposta imune inata à infecção e envolve a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS são tóxicos e funcionar para matar microorganismos fagocitados. In vivo quantificação de derivados de fagócitos ROS fornece informações sobre a capacidade de um organismo para montar uma resposta imune inata robusto. Aqui nós descrevemos um protocolo para quantificar e comparar ROS em embriões de peixe-zebra inteiros após indução química da explosão respiratória dos fagócitos. Este método faz com que a utilização de um composto não fluorescente que se torna fluorescente por oxidação por ROS. Embriões de peixes-zebra individuais são pipetadas para os poços de uma microplaca e incubadas neste substrato fluorogénico com ou sem um indutor químico da explosão respiratória. Fluorescência em cada poço é quantificada em momentos desejados utilizando um leitor de microplacas. As leituras de fluorescência são ajustados para eliminar a fluorescência de fundo e, em seguida, compared usando um teste t não pareado. Este método permite a comparação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra, em diferentes estágios de desenvolvimento e em resposta a manipulações experimentais, tais como o knockdown da proteína, a sobre-expressão, ou a tratamento com agentes farmacológicos. Este método também pode ser utilizado para monitorar a resposta a explosão respiratória em rins dissecados inteiros ou preparações de células de rins de peixe-zebra adultos e algumas outras espécies de peixe. Acreditamos que a relativa simplicidade e capacidade de adaptação deste protocolo irá complementar os protocolos existentes e será de interesse para os pesquisadores que procuram entender melhor a resposta imune inata.

Introdução

O sistema imunitário é constituído por duas ramificações: a imunidade inata e adaptativa. A imunidade inata é evolutivamente mais antiga do que a imunidade adaptativa. Invertebrados são atualmente pensado para ter só a imunidade inata, enquanto os vertebrados possuem ambos os ramos inata e adaptativa. Enquanto a imunidade adaptativa confere imunidade específica e de longa duração a certos patógenos, a imunidade inata é uma resposta imediata às bactérias invasoras, vírus e fungos. Um aspecto importante da resposta imune inata envolve a libertação de citocinas e quimiocinas, o que resulta em inflamação e recrutamento de fagócitos (por exemplo, macrófagos, neutrófilos) para engolir e destruir invasores estranhos.

Respostas imune inata de sucesso envolvem: (1) o reconhecimento de microorganismos invasores, (2) indução das cascatas de sinalização adequadas (por exemplo, liberação de citocinas e quimiocinas), (3) desenvolvimento adequado / número adequado de células fagocíticas, (4) Migração de fagócitos para locais de infecção; (5) imersão de patógenos, e (6) a destruição de microorganismos engoliram. Uma deficiência em qualquer uma dessas etapas pode levar ao host que está sendo oprimido por e sucumbir a, a infecção. Uma resposta imune inata robusta é vital para a saúde dos organismos, porque é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, em todas as plantas e animais. Nos vertebrados, também potencia a resposta imune adaptativa ^1. Portanto, é fundamental que nós somos capazes de avaliar todos os aspectos da resposta imune inata, a fim de entendê-lo melhor e para optimizar a sua função.

Muitos organismos modelo são usados ​​para estudar a imunidade inata, que vão desde a Arabadopsis C. elegans, Drosophila a ratos para as células humanas em cultura. Uma vantagem de se utilizar o peixe-zebra (Danio rerio) sistema modelo para o estudo da imunidade inata é que o peixe-zebra é um vertebrado, com tanto inata e adaptativa imdade, mas o desenvolvimento da imunidade inata e adaptativa são temporalmente segregados. Zebrafish dependa exclusivamente de imunidade inata para a proteção contra a infecção até que a imunidade adaptativa torna-se totalmente funcional, que ocorre cerca de 4-6 semanas após a fertilização ^2. Além de ferramentas para a manipulação genética, a claridade óptica e rápido desenvolvimento, externa, a imunidade inata como o modo de princípio de defesa em embriões de peixe-zebra fornece um modelo simplificado para se estudar a complexidade da resposta imune inata in vivo.

Vários protocolos têm sido desenvolvidas para avaliar diferentes facetas da resposta imune inata em embriões de peixe-zebra. Microarrays e RNAseq validaram que os perfis de citoquinas induzidas pela resposta imune inata do peixe-zebra são semelhantes aos de humanos e têm também sugerido o envolvimento de genes inesperados na imunidade inata ^3,4. A transparência do embrião de peixe-zebra e fluorescente, transgénicacepas ic de patógenos e zebrafish permitir a visualização de interações patógeno-hospedeiro dinâmicos in vivo em tempo real. Embriões de peixes-zebra transgénicos que expressam a GFP sob o controlo do promotor específico de mieloperoxidase de neutrófilos ^5,6 ou o MPEG1 promotor específico de macrófago ⁷ tornaram possível visualizar e quantificar a migração dos fagócitos para os locais de infecções localizadas ^8, bem como para visualizar a fagocitose e destruição de marcada com fluorescência patógenos ^8,9. Embriões de peixes-zebra também são susceptíveis à geração de ensaios de alto rendimento e telas químicos. Por conseguinte, recentemente, têm sido desenvolvidos métodos de alto rendimento de análise do transcriptoma por infecção ¹⁰ e fagócitos migração para os locais de lesão induzida quimicamente ^11.

Das técnicas listadas acima, nenhum avaliar quantitativamente a fase final de destruição patógeno pelos fagócitos. Esta fase finalenvolve uma explosão respiratória (ou seja, produção de ROS e outros compostos tóxicos), que matam os patógenos engoliram. A enzima NADPH-oxidase é uma importante fonte de ROS nas células fagocíticas. Montagem das subunidades dos resultados da enzima NADPH-oxidase de transferência de electrões para o oxigénio, a geração de superóxido. Por meio de reacções enzimáticas subsequentes, superóxido pode então ser convertido em peróxido de hidrogénio e ácido hipocloroso (Figura 1A). É o colapso respiratório de fagócitos que mata organismos patogénicos e assim, a quantificação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra é indicativo de saúde global imune inata. Foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a explosão respiratória em grupos de embriões de peixes-zebra individuais ^12. Este ensaio utiliza a forma não-fluorescente, reduzida de um corante disponível comercialmente, de células-permeável. Este corante, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), é convertido para o fluocomposto cento, 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCF), por oxidação. As diversas ROS geradas pela explosão respiratória dos fagócitos podem oxidar H2DCFDA e gerar fluorescência ^24. O aparecimento de fluorescência pode ser utilizado para quantificar e comparar a resposta de explosão respiratória entre grupos de peixe-zebra. A proteína quinase C de etilo agonista de miristato de forbol (PMA) é utilizado para induzir quimicamente NADPH-oxidase para a produção de ROS e, assim, aumentar as leituras de fluorescência (Figura 1B). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado de uma versão modificada e optimizada deste ensaio explosão respiratória embrião do peixe-zebra. Este ensaio pode ser utilizado para comparar a explosão respiratória entre grupos de embriões de peixes-zebra individuais ao longo do tempo e / ou em resposta a manipulações experimentais (por exemplo, proteína de knockdown morfolino-mediada). O uso deste método, em conjunto com outros ensaios de imunidade inata peixe-zebra, irá fornecer uma imagem mais completa do complexo e críticoresposta imune inata.

Protocolo

1. Cuidados e Manutenção Zebrafish

1. Pecuária: desova Mass adulto zebrafish como descrito anteriormente ^13. Recolhe embriões gerados como anteriormente descrito ^14.
2. Microinjecção (se for o caso): Microinject 1-4 estágio de células de embriões de peixes-zebra com oligonucleótidos morfolino para knockdown produtos do gene ou ARNm para sobre-expressar os produtos dos genes, como previamente descrito ^15.
   1. Manter uma piscina adequada de falsa controles injetados (pelo menos 48 localização, simulada injetado peixes de controle e 48 de vida, o peixe experimentalmente manipulados são necessários para preencher uma microplaca de 96 poços).
3. Manter os embriões: crescer embriões em placas de petri de profundidade a 28 ° C em água de ovo (60 mg / ml instantâneo Oceano sal do mar em água destilada autoclavada de água) até o estágio de desenvolvimento desejado (a resposta explosão respiratória não é detectável usando esse protocolo em embriões de peixe-zebra com menos de 2 dias após a fertilização ^12). Nota: Foi observed que a prevenção da pigmentação em embriões de peixe-zebra, quer através da utilização de 1-fenil-2-tioureia (PTU) ou peixe-zebra mutante golden/slc24a5 não altera significativamente a indução de fluorescência por PMA (dados não publicados, embriões testados aos 48, 72, e 96 hpf).
   1. Retirar embriões mortos diariamente com uma pipeta de transferência de plástico.
   2. Decantar cuidadosamente água ovo velho e reabastecer com água nova ovo por dia.
4. Embriões Dechorionate: No dia da experiência, os embriões dechorionate (se embriões ainda estão nas suas córions) como descrito anteriormente usando duas pinças finas ¹⁴ (este ensaio explosão respiratória também podem ser realizadas sobre os rins dissecados de peixes-zebra adultos ^{de 12} e protocolos detalhados para rim dissecção a partir do peixe-zebra adultos foram previamente descritos ^16,17).

2. Preparação de Solução

1. Prepare uma solução estoque de H2DCFDA: Pesar 1 mg de H2DCFDA.
   1. Dissolve 1 mg de H2DCFDA em 1 ml de dimetil-sulfóxido (DMSO) para fazer uma solução estoque de 1 mg / ml.
   2. Faça 22 mL alíquotas desta solução estoque em 1,7 ml microtubos.
   3. Enrole as alíquotas de solução estoque H2DCFDA em papel alumínio e manter no escuro, sempre que possível, porque H2DCFDA é sensível à luz.
   4. Alíquotas loja H2DCFDA a -20 ° C por até 3 meses.
2. ATENÇÃO - Prepare uma solução estoque de acetato de forbol miristato (PMA): Pesar 1 mg de PMA utilizando equipamento adequado de protecção individual (ou seja, luvas, óculos e máscara).
   1. Dissolve-se PMA em 1 ml de DMSO para produzir uma solução stock de 1 mg / ml.
   2. Faça 11 mL alíquotas de 1,7 ml microtubos.
   3. Armazenar aliquotas de uma solução de estoque de PMA a -80 ° C durante até 3 meses.
3. Preparar uma solução de trabalho de H2DCFDA: No dia da experiência, fazer uma solução de trabalho de H2DCFDA pela adição de 1 parte de solução de estoque de um H2DCFDADMSO parte (500 mg / ml H2DCFDA concentração final). Por exemplo, adicionar 20 ml de solução estoque H2DCFDA e 20 mL de DMSO a uma folha envolto 1,7 ml tubo de microcentrífuga.
4. Preparar uma solução de trabalho de PMA: No dia da experiência, fazer uma solução de trabalho de PMA por adição de 1 parte de solução de estoque de PMA a 49 partes por nucleases água livre (20 ug / ml de concentração final de PMA). Por exemplo, diluir 10 mL de solução stock PMA em 490 mL de água livre de nuclease em um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga.
5. Prepara-se uma solução de dosagem de H2DCFDA: No dia da experiência, fazer uma solução de dosagem H2DCFDA com uma concentração final de 1 ug / ml em água H2DCFDA ovo. Os volumes das soluções preparadas de dosagem pode ser modificado como desejado, mas asseguram que as concentrações finais dos reagentes são mantidos. Para rins, em vez de água do ovo, usar o mesmo volume de medium/F-12 modificado por Dulbecco Eagle (50% de DMEM, 50% de F-12, sem vermelho de fenol). Para tornar a 5 ml de H2DCFDAsolução de dosagem, use uma pipeta de 5 ml sorológico para transferir 5 ml de água ovo (ou DMEM/F-12) em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico embrulhadas em papel alumínio e rotulados 'H'.
   1. Retirar 10 ml de água do ovo (ou DMEM/F-12) a partir das 15 ml tubo cônico rotulados 'H' e descartar.
   2. Adicionar 10 ml de solução de trabalho H2DCFDA no tubo de 15 ml rotulados 'H' e vortex para misturar (este volume é suficiente para 48 embrião ou amostras de rim (metade de um total de 96 poços de microplaca) e esses poços irá fornecer medições do nível de fluorescência de fundo).
6. Prepara-se uma solução de dosagem de H2DCFDA + PMA: No dia da experiência, fazer uma solução de H2DCFDA + PMA dosagem com concentrações finais de: H2DCFDA - 1 ug / ml e PMA - 400 ng / ml. Para tornar a 5 ml de solução de dosagem H2DCFDA + PMA, utilizar uma pipeta de 5 ml serológico para transferir 5 ml de água de ovo (ou DMEM/F-12) para um novo tubo de 15 ml rotulados 'H + P'.
   1. Remover 110 _6; l de água do ovo (ou DMEM/F-12) a partir das 15 ml tubo cônico rotulados 'H + P' e descartar.
   2. Adicionar 10 ul de solução de trabalho de H2DCFDA, depois adicionar 100 mL de solução de trabalho de PMA no tubo de 15 ml rotulados 'H + P' e vortex para misturar (este volume é suficiente para 48 amostras ou a outra metade de um total de 96 poços de microplacas ).
7. Manter as soluções de dosagem no gelo.

3. Programação Leitora

1. Preparar instrumento: Ligue o leitor de microplacas.
   1. Aqueça-se a fonte de luz.
   2. Estabelecer um programa para ler a fluorescência: por exemplo, Excitação: 485 nm; emissão: 528 nm; Optics Posição: top 510 nm; Sensibilidade: 65, com um passo tremendo 5 segundos antes da leitura.

4. Microplaca de 96 poços Set Up (ver Figura 2)

1. Reúna suprimentos: obter pratos com embriões dechorionated, preto microplaca de 96 poços, p200 pipeta edicas, balde de gelo com H2DCFDA e soluções de dosagem H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipeta, dois reservatórios estéreis, folha de alumínio, e uma tesoura.
2. Transferência de um embrião em cada poço de uma microplaca de 96 poços: Use a tesoura para cortar uma ponteira de tal forma que os embriões ou rins passar pela abertura.
   1. Definir um pipetador de p200 para 100 ul e transferir um embrião, juntamente com a água do ovo (ou DMEM/F-12) em que muitos dos poços de uma microplaca de 96 poços preta como desejado (que não é necessário mudar a ponta de pipeta para cada diferente amostra do embrião dentro de uma condição experimental, mas pode ser necessário para mudar entre as pontas condições experimentais). Certifique-se de evitar a transferência de córions residuais, uma vez que estes tendem a distorcer os dados coletados. Para a transferência dos rins, uma pipeta de volume maior (definida como 100 ul) pode ser utilizado e as pontas das pipetas pode ser cortada para se obter um tamanho maior do furo, se necessário. Pode ser necessário incorporar poços sem amostras de embrião ou de rim, mas comas soluções de dosagem para controle de algumas manipulações experimentais.
3. Adicionar soluções de dosagem: despeje solução de dosagem H2DCFDA em um estéril 25 ml reservatório.
   1. Usar uma pipeta multicanal p200 e oito pontas de pipeta, simultaneamente 100 jil de solução de dosagem H2DCFDA em uma coluna na microplaca de 96 poços (500 concentração ng / ml final H2DCFDA).
   2. Repita este (trocando as pontas não é necessário) para as colunas desejado (geralmente seis colunas ou 48 poços se preenchendo toda uma microplaca de 96 poços). Adicionar esta solução a metade das amostras de controlo e de embrião de metade das amostras de embrião experimentalmente manipuladas (por exemplo, de 96 poços de microplacas configuração é mostrado na Figura 2, estes poços (cor de laranja) irá fornecer dados de fluorescência de fundo em amostras não induzidas com PMA) .
   3. Verter a solução de dosagem H2DCFDA + PMA numa nova, estéril 25 ml de reservatório.
   4. Use um p200 pipeta multicanal e oito dicas para Simultaneously pipeta 100 uL da solução de dosagem H2DCFDA + PMA nas colunas restantes (cor vermelha na Figura 2) da microplaca de 96 poços (mudar as pontas não é necessário, as concentrações finais de H2DCFDA-500 ng / ml e PMA a 200 ng / ml) .
4. Cobrir a microplaca com papel alumínio.
5. Agitar a microplaca por aproximadamente 20 segundos a 150 rpm para homogeneizar as soluções em cada poço.
6. Incubar a microplaca a 28 ° C quando não está a ser lida.

5. Fluorescência Quantificação

1. Leia a microplaca no tempo = 0 horas após a adição do PMA usando os parâmetros descritos no passo 3.1.2.
   1. Continuar a tomar medidas a cada poucos minutos, para o intervalo de tempo desejado ou incubar a folha enrolada microplaca a 28 ° C até um ponto de tempo mais tarde e, em seguida, fazer uma medição de ponto de extremidade a um tempo desejado (por exemplo, 4 horas após a adição do PMA).
2. Use um plástico transferência pipeta para recuperar os embriões a partir dos poços.
3. Eutanásia os embriões de acordo com o seu cuidado com os animais e protocolo de uso, por exemplo, imersão em tricaina MS222.
4. Descarte a microplaca e outros materiais descartáveis ​​no recipiente de resíduos de risco biológico.

6. Análise de Dados

1. Decidir sobre o ponto no tempo em que você gostaria de comparar os valores de fluorescência (por exemplo, 4 horas após a adição de PMA, a Tabela 1).
2. Subtrair o valor de fluorescência do grupo controle média induzida por un dos valores de fluorescência do grupo controle induzido por PMA individual.
3. Repita este procedimento para o grupo experimental com e sem PMA.
4. Armazene esses valores de fluorescência normalizados em duas colunas, o controle + grupo PMA eo experimental + grupo PMA (Tabela 2).
5. Calcular as médias e desvios-padrão para os valores de fluorescência normalizados do controle + PMA group eo grupo + PMA experimental.
6. Comparar os valores de fluorescência normalizados utilizando um teste t não emparelhado para determinar a significância estatística (Tabela 2).
7. Gráfico dos meios de controle + grupo + PMA eo grupo PMA experimental com barras de erro refletindo os desvios padrões apropriados.
8. Registe o nível de significância no gráfico e na legenda da figura (Figura 2).

Resultados

Aqui, nós fornecemos dados comparando a resposta explosão respiratória em embriões de peixe-zebra (tipo selvagem, AB de fundo) em 48 e 72 horas pós fertilização (hpf). Os 48 embriões HPF atuou como nosso grupo controle e os 72 hpf embriões como nosso grupo experimental. O tamanho da amostra utilizada foi de 24 embriões induzida por un e 24 embriões induzidas PMA por estágio de desenvolvimento. Leituras de fluorescência em bruto (em unidades de fluorescência relativas (RFU)) foram obtidas através da leitur...

Discussão

A principal função dos fagócitos é detectar, engolfar e destruir patógenos. A capacidade dos fagócitos para produzir uma explosão respiratória adequado é crítico para esta função. Assim, a quantificação da resposta explosão respiratória é um método para permitir a comparação de saúde imune inato geral e função entre grupos de indivíduos e / ou em resposta a manipulações experimentais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para induzir, quantificar e comparar a resposta explosão respiratória ent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478