单线粒体超氧闪烁在完整心脏或共聚焦成像<em&gt;在体内</em

摘要

共聚焦扫描显微镜是适用于在成像灌注心脏或骨骼肌线粒体单事件活的动物。单个线粒体过程，如超氧化物闪烁和膜电位的波动进行实时监控，使线粒体功能的评价在生理相关的背景和病理过程中的扰动。

摘要

线粒体是负责能源生产和细胞内信号在真核系统中的关键细胞内的细胞器。线粒体功能障碍常伴随并有助于人类疾病。已开发，以评估线粒体功能和功能障碍的方法的大多数都是在体外或离体测量的基础上。这些实验的结果具有有限的在确定体内的线粒体功能的能力。在这里，我们描述了一种新的方法，利用激光共聚焦扫描显微镜对完整的组织的活缩醛胺的成像，其允许单个线粒体功能的评价在一个实时的方式在体内 。首先，我们生成表达线粒体超氧针对性的指标，循环置换黄色荧光蛋白（MT-cpYFP）转基因小鼠。麻醉MT-cpYFP鼠标固定在一个特制的舞台适配器和时间推移图像拍摄fROM中的后肢暴露的骨骼肌。鼠标随后被处死，心脏被设置为Langendorff灌流与生理溶液在37°C灌注心脏被定位在一个特殊的腔上的共聚焦显微镜阶段，温柔的压力施加到固定的心脏，抑制心脏的跳动引起的运动伪影。超氧化物闪烁是由实时二维共焦成像，每秒1帧的频率检测到。该灌注溶液可修改成包含不同呼吸底物或其它荧光指示剂。灌注也可以进行调整，以产生疾病模型，如缺血再灌注损伤。这种技术是用于确定单个线粒体在完整的组织和体内的功能的独特的方法。

引言

线粒体在细胞生物能量核心作用，自由基信号，氧化还原平衡，离子调控和细胞命运决定^1,2。线粒体功能障碍常伴和的基础疾病^3-6的发病机制。尤其是在肌肉系统，如心脏和骨骼肌线粒体呼吸提供了广大的ATP以支持及时调控细胞内钙离子和强大的开发力量^7,8。这些肌肉具有大量线粒体经常占据高达总细胞体积的20-40％，并在肌丝²之间被“固定”的。

尽管大量的研究，我们对线粒体功能的调节，特别是在体内和在生理学相关条件的理解，是有限的。其中一个原因是，多数的评价线粒体功能开发的方法依赖于在VITRo或体外的方法，如监测分离线粒体辅以人工基质的耗氧量，并通过形态学（ 如电子显微镜），酶的活性（ 如乌头酸酶活性）的间接测定线粒体功能，或细胞内ATP水平^9-11 。

最近，小分子荧光指示剂与线粒体相对富集已应用于提供一瞥线粒体信号，包括膜电位，钙和活性氧簇（ROS），在完整细胞中^11-13。此外，一些绿色荧光蛋白（GFP）的氧化还原和ROS指标，已经开发了实现了条块细胞内的氧化还原或ROS信号^14-16的更具体的评价。这中间，我们开发了一种基因编码的超指标，圆形排列的黄色荧光蛋白，并targeteD它进入线粒体^{（MT-cpYFP）17。} MT-cpYFP可以在405或488 nm的激发与在515 nm的两个发射峰。在488nm激发的发光是专门响应于在体外和体内的校准^17,18所示由以前超氧。在405nm处激发的发光被用作内部控制（请参考图1号17的对MT-cpYFP的发射光谱和激发光谱的详细信息在各种条件下）。随着时间推移共焦成像，这一指标检测爆棚超生产活动，名为超氧化物闪烁，在单个线粒体完整细胞。超闪作为线粒体呼吸，伴随的瞬态线粒体膜去极化和活性氧的产生^17-20的复合函数。最近，我们已经生成使用PUC-CAGGS-MT-cpYFP矢量^17,19上C57/BL6背景的泛组织MT-cpYFP转基因小鼠和验证了强烈的表达锡永这一指标在心脏，骨骼肌等组织中（ 图2）。根据要求和MTA批准由华盛顿大学的转基因小鼠将供感兴趣的学术研究。

在这项研究中，我们描述了在超闪烁的Langendorff灌流心脏原位成像以及体内成像的麻醉MT-cpYFP转基因小鼠^17,19骨骼肌Flash事件。此技术允许在生理相关的条件下或在体内^21,22单个线粒体ROS产生事件的实时监控。它也是可行使用该系统来监测其它单线粒体参数如膜电位和钙与适当的荧光指示剂。与细胞内事件（ 如钙瞬变）或心脏功能（线粒体功能进一步，同步或并行的评价如。射血分数）就可以实现。病理扰动，如局部缺血和再灌注，可以被应用到灌注心脏评估应力对未受影响的心肌单线粒体功能的影响。

研究方案

1。实验准备

1. 制备含有等渗平衡盐溶液（50毫升）：140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，2.5mM的_氯化钙 ，2毫摩尔MgCl ₂和10mM HEPES（pH 7.2）中， 在体内骨骼肌成像。
2. 制备1升含的Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）：118 mM氯化钠，5.3 mM的氯化钾，1.2mM的MgSO ₄干燥，0.5mM的EDTA和25mM的NaHCO _3。
3. 气泡的KHB与含氧气体95％O _{2/5％CO 2} 10-15分钟之前，加入2mM的CaCl _2。添加代谢底物（ 如 10毫米的葡萄糖和0.5 mM的丙酮酸）。
4. 通过灭菌在70％乙醇钳，剪刀，镊子和然后漂洗于灭菌双蒸₂ O制备的外科器械
5. 打开心脏灌注系统上，调整在水浴和环行器的温度，设置蠕动泵的速度到6毫升/分钟。
6. 泡沫高雄港务局与95％的O ₂/ 5％CO ₂气体，并监测流出物的流率和温度（37℃，通过一个光纤温度探头）。该系统需要大约20分钟的气体和温度平衡。

2。骨骼肌在体内的共聚焦成像

1. 麻醉小鼠用戊巴比妥（80毫克/千克，IP）。动物将在10-15分钟达到手术麻醉（以脚趾捏无响应），并保持在此状态为1-1.5小时，足以使骨骼肌的体内成像。
2. 在后肢之一除去毛发和消毒用70％乙醇在皮肤上。
3. 使上沿肢体，以暴露腓肠肌外侧皮肤上的切口。
4. 轻轻拿起肌外膜用锋利的钳子和做一个切口，通过用剪刀。进一步剖析，除去肌外膜和揭露肌纤维下方。
5. 用于体内装载TMRM进入骨骼肌肉，包括TMRM（500纳米）的等渗平衡盐溶液浸渍肌肉30分钟，然后洗出由指示器无解。
6. 把鼠标在其一侧上的共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510）的阶段，抑制后肢在该露出骨骼肌面临对形成所述腔室的底部的盖玻片的位置上。盖玻片是在肌肉组织和反相物镜（40X油）之间。
7. 按腿轻轻放下，使组织和盖玻片之间的紧密接触。沉浸在等渗平衡盐溶液暴露的肌肉。
8. 记录二维（2D，xy）的共焦图象以每帧一秒的采样率。每个像素的强度被数字化，以8位深度。通常，一个串行扫描包含100帧。
9. 在> 505nm处收集顺序图像由第1激励在405nm处，并收集，然后在488nm处> 505 nm的收集，同时对双波长激励下MT-cpYFP n个影像。使用顺序激发在405，488和543 nm，而在505-545收集排放，505-545，和> 560 nm处，分别为MT-cpYFP和TMRM的三波长激发成像。

3。的灌注小鼠心脏共聚焦成像

1. 骨骼肌的体内成像后立即用200单位肝素钠（IP）的注射的小鼠。十几分钟后，安乐死鼠标开胸并迅速连接到它的肺和胸腺取出心脏。
2. 在冰冷的缓冲液快速清除肺部。识别胸腺瓣，轻轻剥开，露出升主动脉。
3. 取出胸腺和仔细去除任何周围组织分离主动脉。
4. 主动脉弓的第一分支之前做一个切口在升主动脉的上端。
5. 用两个微缝合镊持有的主动脉壁轻轻地以暴露腔和主动脉小心放置到大约nnula（PE50管）。主动脉被保持在适当位置用一个微型钳容器而缝合线围绕主动脉迅速栓。
6. 取出钳，仔细检查套管钳，以确保套管的尖端高于主动脉根部。其他关系都根据需要添加，以固定的心脏。
7. 打开蠕动泵并在1毫升/分钟灌注心脏。心脏会恢复灌注后跳动。
8. 调整灌注系统的位置，把心脏上的显微镜载物台。该阶段有一个适配器，允许保存心脏的腔室加热。
9. 加入1 ml的KHB灌注液在室部分淹没的心脏。监视室的温度在37℃。通过使用蠕动泵从腔室中移除流出物。
10. 提高蠕动泵的速度逐渐以提供足够的流量（大约2毫升/分钟）至心脏。
11. 后稳定10分钟，灌注老天室温下用10μMII型肌球蛋白和100-500纳米TMRM。 10分钟后，心脏跳动会减慢。
12. 适用于心脏温和的压力，以确保心脏的紧密接触盖玻片在腔室的底部，并进一步抑制心跳。
13. 按照相同的程序，如上面的步骤2.8所描述完整的心肌的共聚焦成像。仔细调整焦平面显露最清晰的图像成为可能。

4。图像处理和数据分析

1. 使用由共聚焦软件来分析单个线粒体闪烁和膜电位变化的“生理学分析”模块提供的工具。该模块通常被包括在共聚焦系统的图像获取软件，并允许确定的特定区域的图像中，以及荧光强度的输出与时间标签。
2. 打开数据库并进行分析，然后串行2D图像文件。
3. 点击“区域权益回报率（ROI）的意思是“切换到”平均投资回报率的“模式。点击”感兴趣区域（ROI）的意思是“切换到”平均投资回报率的“模式。
4. 关闭其它信道的不同之处cpYFP 488nm的用于选择闪烁的信道的显示。
5. 放大图像并​​手动移动滑动条玩串行2D图像。
6. 通过查找网站，荧光信号增加瞬时识别单个线粒体超氧化物闪烁。使用适当的投资回报率的工具，以纪念闪烁。跟踪显示每个ROI的时间依赖性荧光的变化将出现在图像旁。
7. 选择所有闪烁后，打开其他渠道的显示屏上。选择单元格的背景信号减法之外在图像上的投资回报率。输出的每个ROI的平均荧光连同时间标记。
8. 与扫描时间和面积闪烁记录在每个串行扫描的图像文件的数目一起的细胞。使用Excel来计算闪光频率为每100秒/ ^1,000μm2的电池面积闪烁的数字。
9. 使用写在交互式数据语言（IDL，ResearchSystems）来计算每个闪存（振幅，达峰时间和衰减时间）的参数定制开发的程序。 IDL软件是市售和闪光灯参数分析的定制开发的程序可以从作者要求索取。

结果

原位成像灌注心脏（ 图1），根据该协议，单个线粒体事件的体内成像可以在麻醉小鼠的骨骼肌完成之后。的成像条件的最佳设置将确保清晰的图像的完整肌肉组织中，并与单一的线粒体的分辨率（ 图2）。 TMRM经常被用来验证的mt-cpYFP的位置和应显示一个完整的重叠图案与MT-cpYFP信号（ 图2）。 TMRM对于在完整细胞中²³线粒体膜电位的测定...

讨论

成像在活的动物或器官灌注线粒体单事件具有比传统方法的线粒体功能评价^{17,19,21,22,24,25}显著优势。这里描述的技术可以实现实时的在一个真实的生理状态在亚细胞分辨率线粒体功能的原位测定。这是特别有用的，当与其它测量值相结合，系统地研究线粒体在体内特定器官或细胞类型的正常功能的作用。这是一个复杂的技术，它结合了共焦显微术和复杂的灌注系统的各...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.