シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング<em&gt;インビボ</em

要約

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。

要約

ミトコンドリアは、真核生物系でのエネルギー生産と細胞内シグナル伝達を担う重要な細胞内小器官である。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属の、人間の病気に貢献しています。ミトコンドリア機能および機能不全を評価するために開発されてきたアプローチの大部分は、in vitroまたはex vivoで測定に基づいている。これらの実験からの結果は、in vivoでのミトコンドリア機能を決定する上での能力が限られている。ここでは、 インビボでリアルタイムに単一ミトコンドリア機能の評価を可能にするライブアミナール中の無傷の組織のイメージング、共焦点走査顕微鏡法を用いた、新たなアプローチを記載する。まず、ミトコンドリアの対象とスーパーオキシドインジケータ、円順列黄色蛍光タンパク質（MT-cpYFP）を発現するトランスジェニックマウスを作製。麻酔をかけたMT-cpYFPマウスがカスタムメイドステージアダプタに固定され、タイムラプス画像は、Fをとっている後肢の露出骨格筋ROMをマウスはその後、犠牲にされ、心臓は37℃で、生理的なソリューションをランゲンドルフ灌流用に設定されている灌流心臓を共焦点顕微鏡ステージ上に特殊なチャンバ内に配置され、穏やかな圧力は、心臓を固定し、心拍誘導運動アーチファクトを抑制するために適用される。スーパーオキシド点滅毎秒1フレームの周波数でのリアルタイム二次元共焦点イメージングにより検出される。灌流溶液は、異なる呼吸基質または他の蛍光指示薬を含有するように修飾することができる。灌流はまた、虚血および再灌流などの疾患モデルを生成するように調整することができる。この技術は、無傷の組織およびインビボでの単一ミトコンドリアの機能を決定するためのユニークなアプローチである。

概要

ミトコンドリアは、細胞の生体エネルギー、フリーラジカルシグナル伝達、酸化還元ホメオスタシス、イオン調節、および細胞運命決定^の1,2において中心的な役割を果たす。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属のと病気^3-6の病因の基礎となる。特に、心臓や骨格筋などの筋肉のシステムでは、ミトコンドリアの呼吸は、細胞内カルシウム、堅牢な力開発^7,8のタイムリーな調整を支援するために、ATPの大部分を提供します。これらの筋肉は、多くの場合、全細胞容積20〜40％まで占め、筋フィラメント²間に「固定」されたミトコンドリアの多数を持っている。

多くの研究にもかかわらず、ミトコンドリア機能調節の我々の理解は、特に生体内および生理学的に関連する条件下では、限られている。理由の一つは、ミトコンドリア機能を評価するために開発された方法の大部分はvitrに頼るあるこのような人工基質を補充した単離ミトコンドリアの酸素消費量、および間接形態学を通じてミトコンドリア機能の決定（ 例えば電子顕微鏡）、酵素活性（ 例えばアコニターゼ活性）、または細胞内ATPレベル^9から11の監視などoまたはex vivoでのアプローチ、 。

最近では、相対的なミトコンドリア富化を有する小分子蛍光指示薬は、無傷の細胞における膜電位、カルシウムおよび活性酸素種^{（ROS）、11-13}を含むミトコンドリアシグナルの姿を提供するために適用されている。さらに、いくつかの緑色蛍光タンパク質（GFP）をレドックス系、ROS指標区画化、細胞内の酸化還元またはROS ^14-16信号のより具体的な評価を達成するために開発されてきた。この中でも、我々は、遺伝的にコード化されたスーパーオキシドインジケーター、円形の順列黄色蛍光タンパク質、およびtargeteを開発Dそれミトコンドリア^{（MT-cpYFP）17}に変換する。 MT-cpYFPは、515 nmでの発光ピークの両方で405又は488nmで励起することができる。 488nm励起での発光は、 インビトロおよびインビボ較正 ^17,18 内の前で示すように、スーパーオキシドに特異的に応答する。 405 nm励起の発光は、（様々な条件の下で、MT-cpYFPの発光および励起スペクトルの詳細については文献[17の図1をご参照ください）​​内部コントロールとして使用されます。タイムラプス共焦点イメージングでは、この指標は、無傷の細胞の単一ミトコンドリア内スーパーオキシド産生のイベント、というスーパーが点滅し、破裂を検出。スーパーフラッシュは、ミトコンドリア呼吸、添付過渡ミトコンドリア膜脱分極およびROS産^17〜20の合成関数として機能します。最近では、C57/BL6の背景をpUC-CAGGS-MT-cpYFPベクトル^17,19を使用したパン-組織MT-cpYFPトランスジェニックマウスを作製し、強力なEXPRESを確認しました心臓、骨格筋および他の組織（ 図2）で、この指標のシオン。トランスジェニックマウスは、要求とワシントン大学のMTAの承認を得て興味を持って、学術研究者のために利用できるようになります。

本研究では、 その場でのランゲンドルフ灌流し、心臓内のスーパーオキシドが点滅の撮影だけでなく、麻酔MT-cpYFPトランスジェニックマウス^17,19の骨格筋におけるFlashイベントのin vivoイメージングに説明します。この技術は、生理学的に関連する状態またはin vivo ^21,22の単一ミトコンドリアのROS産生のイベントのリアルタイム監視が可能になります。このような適切な蛍光指示薬を有する膜電位およびカルシウムなどの他の単一ミトコンドリアのパラメータを監視するシステムを使用することも可能である。細胞内のイベント（ 例えば 、カルシウムトランジェント）や心臓の機能（ 例えばとミトコンドリア機能の更なる、同時またはパラレル評価。駆出率）を達成することができる。例えば、虚血および再灌流のような病理学的摂動は、無傷心筋の単一ミトコンドリア機能に対するストレスの影響を評価するために灌流心臓に適用することができる。

プロトコル

1。実験の準備

1. 140mMのNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl _2、2mMのMgCl ₂および10mM HEPES インビボでの骨格筋イメージング用液（pH 7.2）を含有する等張平衡塩類溶液（50ml）に調製する。
2. 118のNaCl、5.3のKCl、1.2のMgSO _4、0.5mMのEDTAおよび25mMの_炭酸水素ナトリウム_を ：含むクレブス-ヘンゼライト緩衝液（KHB）を1リットル調製。
3. 従来2mMのCaCl _2を添加する10〜15分間、95％O _{2/5％CO 2を}含むガスと気泡KHB。代謝基質（ 例えば 、10 mMグルコースおよび0.5mMのピルビン酸）を追加します。
4. 70％エタノールでクランプ、はさみ、鉗子を滅菌した後、滅菌蒸留H ₂ Oにすすぐことにより手術器具を準備します
5. 、心臓の灌流システムの電源を入れ、水浴、サーキュレータの温度を調整し、6ミリリットル/分に蠕動ポンプの速度を設定します。
6. 95％O ₂と気泡KHB流出物/ 5％CO ₂ガス、および（光ファイバ温度プローブによって37℃）、流速および温度を監視する。システムは、ガスと温度平衡化のために約20分を必要とします。

2。 in vivoでの骨格筋の共焦点イメージング

1. ペントバルビタール（80 mg / kgで、腹腔内）でマウスを麻酔。動物は、10〜15分以内に、手術の麻酔（つま先のピンチに応答なし）に到達し、骨格筋のin vivoイメージングのために十分な1〜1.5時間、この状態のままになります。
2. 後肢の1に毛を削除し、70％エタノールで皮膚を消毒する。
3. 腓腹筋を露出させ、肢の外側に沿って皮膚に切開する。
4. 鋭いピンセットで軽く筋外膜をピックアップし、ハサミでそれを介して切開する。さらに筋外膜を取り外し、その下の筋線維を露出するために解剖。
5. 骨格へのTMRM のin vivoロード用筋肉は、30分間の筋肉を浸した後、指示薬を含まない溶液で洗い流すこと等張平衡塩類溶液中のTMRM（500 nM）を含める。
6. 共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 510）ステージ上で横にマウスを置くと、公開される骨格筋は、チャンバーの底部を形成するカバーガラスに対向する位置に、リア手足を拘束。カバースリップは、筋肉組織および反転対物レンズ（40X油）との間にある。
7. 組織とカバーガラスの間に密着させるようにそっと足を押してください。等張平衡塩溶液中で公開される筋肉を浸す。
8. フレームあたり1秒のサンプリングレートで録音する2次元（2D、 メトキシ）共焦点画像。各画素の強度は、8ビットの深度でデジタル化される。通常、シリアルスキャンは100フレームが含まれています。
9. > 505 nmで最初の405 nmでのエキサイティングで収集することにより連続した画像を収集し、488 nmの二波長excitatio用> 505 nmで収集しながら、MT-cpYFPのNイメージング。 MT-cpYFPとTMRMの三波長励起イメージングのために、それぞれ、405、488および543 nmで連続励起を使用し、505から545の発光を収集し、505から545、および> 560 nmの。

3。灌流マウス心臓の共焦点イメージング

1. すぐに骨格筋のin vivoイメージングの後、ヘパリン200単位（IP）でマウスを注入します。 10分後、開胸術により、マウスを安楽死させるとすぐにそれに接続されている肺や胸腺で心を取り除く。
2. すぐに氷冷緩衝液で肺を削除します。胸腺の葉を識別し、ゆっくりと上行大動脈を露出するために戻ってはがします。
3. 胸腺を取り外し、慎重に周囲の組織を除去することにより、大動脈を隔離。
4. 大動脈弓の最初の分岐の前に、上行大動脈の上端の切断を行う。
5. ルーメンを露出するために2マイクロ縫合鉗子で穏やかに大動脈の壁を持って、慎重にCAに大動脈を配置nnula（PE50チューブ）。縫合糸が迅速に大動脈の周りに縛られている間は、マイクロ大動脈血管クランプで所定位置に保持される。
6. カニューレの先端が大動脈基部より上であることを確認するために鉗子でカニューレをチェックし、慎重に、クランプを取り外します。追加の関係を所定の位置に心臓を保持するために必要に応じて添加される。
7. 蠕動ポンプの電源を入れ、1ミリリットル/分で心臓を灌流。心臓は、灌流の際に暴行を再開します。
8. 灌流システムの位置を調整し、顕微鏡ステージ上で心を置く。ステージは、心を保持しているチャンバーの加熱を可能にするアダプタを持っています。
9. 部分的に心を沈めるためにチャンバー内KHB灌流溶液1mlを加える。 37℃のチャンバーの温度を監視する蠕動ポンプを使用することにより、チャンバからの流出物を除去します。
10. 心臓への十分な流量（約2ミリリットル/分）を提供するために、徐々に蠕動ポンプの速度を増加させる。
11. 安定化の10分後、ょんを潅流10μMのブレビスタチンおよび100〜500nmのTMRMとRT。ハートビートは10分後に遅くなります。
12. チャンバーの下部にあるカバーガラスで心​​の緊密な接触を確実にするために、さらにハートビートを抑制するために心に静かに押し込みます。
13. 上記のステップ2.8で説明したように完全な心筋の共焦点イメージングのためのと同じ手順に従ってください。慎重に可能な鮮明な画像を明らかにするために、焦点面を調整します。

4。画像処理およびデータ分析

1. シングルミトコンドリアが点滅し、膜電位変化を分析するために、共焦点ソフトウェアの「生理的分析」モジュールによって提供されるツールを使用してください。このモジュールは、多くの場合、共焦点システムの画像取得ソフトウェアに含まれる画像の中の特定の領域の決定だけでなく、時間ラベルとの蛍光強度の出力を可能にする。
2. データベースと分析しようとする、シリアル2D画像ファイルを開きます。
3. 「地域をクリックしてください関心領域（ROI）は、平均ROIの "に切り替える」という意味の平均ROIの「モード」に切り替え、「関心領域（ROI）は、平均"モード。をクリックして "。
4. 点滅を選択するためのcpYFP 488nmのチャンネルを除く他のチャンネルの表示をオフにします。
5. ズーム画像と手動シリアル2D画像を再生するために、スライドバーを移動します。
6. 蛍光シグナルが一過性に増加し、サイトを配置することにより、単一のミトコンドリアのスーパーオキシドが点滅を識別します。点滅をマークするために、適切なROIツールを使用します。各ROIの時間依存蛍光変化を示すトレースは、画像の横に表示されます。
7. すべての点滅を選択した後、他のチャンネルの表示をオン。バックグラウンド信号の減算の​​ための細胞の外側で画像にROIを選択します。一緒に時間ラベルで出力各ROIの平均蛍光を。
8. のスキャン時間と面積と一緒にシリアルスキャンされた画像ファイルのそれぞれに点滅回数を記録しますセル。 Excelを使用して100秒/ ^1,000μm2のセル面積あたりの点滅回数などのフラッシュ頻度を計算する。
9. 各フラッシュ（振幅、ピークまでの時間と減衰時間）のパラメータを計算するために対話型のデータ言語（IDL、ResearchSystems）で記述されたカスタム開発されたプログラムを使用してください。 IDLのソフトウェアは市販されており、フラッシュパラメータ解析用のカスタム開発されたプログラムは、要求に応じて作成者から得ることができます。

結果

このプロトコルによると、単一のミトコンドリアのイベントのin vivoイメージングは、麻酔したマウスの骨格筋で行うことができますが灌流し、心臓内のその場での画像（ 図1） に続く。撮影条件の最適な設定は、そのまま筋肉組織の鮮明な画像を確保し、単一ミトコンドリアの解像度（ 図2）となります。 TMRMは、多くの場合、MT-cpYFPの場所を確?...

ディスカッション

生きた動物または灌流さの臓器の単一ミトコンドリアのイベントを画像化することは、ミトコンドリア機能評価^{17,19,21,22,24,25}のための従来の方法に比べて大きな利点があります。ここに記載された技術は、細胞内の解像度で、実際の生理学的状態にあるミトコンドリア機能のその場での決定に 、リアルタイムを実現することができます。全身的にインビボで特定?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.