ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Summary

מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ובמהלך ההפרעות פתולוגיות.

Abstract

Mitochondrion הוא אברון תאיים קריטי אחראי על ייצור אנרגיה ואיתות תאית במערכות אוקריוטים. תפקוד המיטוכונדריה לעתים קרובות מלווה ותורם למחלות בבני אדם. רוב הגישות שפותחו כדי להעריך את התפקוד ותפקוד המיטוכונדריה מבוססים על במבחנה או מדידות vivo לשעבר. יש תוצאות מניסויים אלה בקביעת יכולת תפקוד המיטוכונדריה in vivo מוגבלות. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית אשר מנצלת מיקרוסקופיה confocal סריקה עבור ההדמיה של רקמות שלמות בaminals החי, המאפשרת ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה אחת באופן בזמן אמת בגוף חי. ראשית, עלינו ליצור עכברים מהונדסים המבטאים את מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה הממוקד, חלבון permuted מעגלית צהוב ניאון (MT-cpYFP). MT-cpYFP הרדים עכבר קבוע במתאם שלב מחוייט וזמן לשגות תמונות נלקחות from שרירי שלד החשוף של hindlimb. העכבר הקריב לאחר מכן והלב מוגדר לזלוף Langendorff עם פתרונות פיסיולוגיים ב 37 ° C. לב perfused ממוקם בתא מיוחד על הבמה מיקרוסקופ confocal ולחץ עדין מוחל כדי לשתק את הלב ולדכא את פעימות לב חפץ בתנועה מושרה. הבזקי סופראוקסיד מזוהים על ידי ההדמיה confocal 2D בזמן אמת בתדר של מסגרת אחת לשנייה. פתרון זלוף יכול להיות שונה כדי להכיל את מצעי נשימה שונים או אינדיקטורים ניאון אחרים. זלוף גם יכול להיות מותאם כדי לייצר מודלים מחלה כגון איסכמיה ו reperfusion. טכניקה זו היא גישה ייחודית לקביעת הפונקציה של המיטוכונדריה בודדת ברקמות שלמות וin vivo.

Introduction

מיטוכונדריה לשחק תפקיד מרכזי בbioenergetics תא, איתות של רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס חיזור, רגולציה יון, ^ו1,2 קביעת גורל תא. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ולעתים קרובות מלווה ביסוד פתוגנזה של מחלות ^3-6. במיוחד במערכות השרירים כגון לב ושרירי שלד, נשימה המיטוכונדריאלי מספקת את הרוב של ה-ATP לתמיכה ברגולציה בזמן של סידן תוך תאי ^ו7,8 פיתוח כוח חזק. שרירים אלה יש מספר גדול של מיטוכונדריה כי לעתים קרובות לכבוש עד 20-40% מכלל נפח התא והם "קבועים" בין myofilaments ^2.

למרות מחקרים רבים, ההבנה של הרגולציה התפקוד המיטוכונדריה, במיוחד in vivo ובתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שלנו, מוגבלת. אחת הסיבות הוא כי רוב השיטות שפותחו להערכת תפקוד המיטוכונדריה להסתמך על בvitro או vivo לשעבר גישות, כגון ניטור צריכת החמצן של מיטוכונדריה המבודדת בתוספת מצעים מלאכותיים, והקביעה העקיפה של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מורפולוגיה (מיקרוסקופיה למשל אלקטרון), פעילות האנזים (פעילות aconitase למשל), או רמות ה-ATP תאית ^9-11 .

לאחרונה, אינדיקטורים ניאון מולקולה קטנים עם העשרת המיטוכונדריה היחסית יושמו כדי לספק הצצה אותות המיטוכונדריה, כוללים פוטנציאל ממברנה, סידן ומיני חמצן תגובתי (ROS), בתאים שלמים ^11-13. יתר על כן, כמה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חיזור מבוסס ואינדיקטורים ROS פותחו כדי להשיג הערכה ספציפית יותר של חיזור תאיים הממודר או ROS מאותת ^14-16. בקרב זה, פיתחנו אינדיקטור מקודד גנטי סופראוקסיד, חלבון פלואורסצנטי הצהוב permuted המעגלי, וtargeteד אותו למיטוכונדריה (MT-cpYFP) ^17. יכול להיות נרגש MT-cpYFP ב405 או 488 ננומטר עם שתי פסגות הפליטה ב 515 ננומטר. הפליטה ב 488 עירור ננומטר היא דווקא מגיבה לסופראוקסיד כפי שמוצג על ידי קודם במבחנה בכיולי vivo ^17,18. הפליטה ב 405 עירור ננומטר משמשת כבקרה פנימית (עיין באיור 1 של Ref 17 למידע מפורט על ספקטרום הפליטה ועירור של MT-cpYFP בתנאים שונים). עם confocal הדמיה הזמן לשגות, אינדיקטור זה מזהה מתפוצץ אירועי סופראוקסיד ייצור, בשם הבזקי סופראוקסיד, במיטוכונדריה בודדת של תאים שלמים. הבזק סופראוקסיד משמש כפונקציה משולבת של נשימה המיטוכונדריאלי, שלילת קוטביות קרום נלווית חולפת המיטוכונדריה וייצור ROS ^17-20. לאחרונה, יש לנו שנוצרו העכברים הטרנסגניים MT-cpYFP הפאן רקמות באמצעות וקטור PUC-CAGGS-MT-cpYFP ^17,19 על רקע C57/BL6 ואימתו את הביטויים חזקיםשיאון של אינדיקטור זה בלב, שרירי שלד ורקמות אחרות (איור 2). העכברים מהונדסים יהיו זמינים לחוקרים אקדמיים מעוניינים על פי דרישה וMTA אישור על ידי אוניברסיטת וושינגטון.

במחקר זה, אנו מתארים בהדמיה באתרו של הבזקי סופראוקסיד בלב perfused Langendorff כמו גם in vivo הדמיה של אירועי הבזק שברירי שלד של עכברים הטרנסגניים הרדים MT-cpYFP ^17,19. טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועי ייצור ROS המיטוכונדריה אחד במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית או in vivo ^21,22 זמן אמת. זה גם אפשרי על מנת להשתמש במערכת לניטור פרמטרים המיטוכונדריה אחת אחרים כגון פוטנציאל קרום וסידן עם אינדיקטורים ניאון מתאימים. הערכה נוספת, בו זמנית או במקביל של תפקוד המיטוכונדריה עם אירועים תאיים (למשל ארעיים סידן) או את תפקוד לב (לדוגמא:. פליטת חלקיק) יכול להיות מושגת. הפרעות פתולוגיות, כגון איסכמיה ו reperfusion, יכולות להיות מיושמות על לב perfused כדי להעריך את ההשפעה של מתח על תפקוד המיטוכונדריה בודד בשריר הלב ללא פגע.

Protocol

1. ניסוי הכנה

1. הכן את התמיסה איזוטונית מאוזנת מלח (50 מיליליטר) המכילה: 140 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl _2, 2 מ"מ MgCl ₂ ו10 HEPES מ"מ (pH 7.2) עבור in vivo הדמיה שרירי שלד.
2. הכן 1 ליטר של חיץ קרבס-Henseleit (KHB) המכיל: 118 mM NaCl, 5.3 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO _4, 0.5 mM EDTA ו25 מ"מ NaHCO _3.
3. בועת KHB עם 95% O גז המכיל _2/5% CO ₂ למשך 10-15 דקות לפני התוספת של 2 מ"מ CaCl _2. הוספת מצעים מטבולים (למשל 10 גלוקוז מ"מ ו0.5 פירובט מ"מ).
4. הכן את מכשירי ניתוח על ידי חיטוי המהדק, מספריים, מלקחיים ב70% אתנול ולאחר מכן לשטוף בDDH ₂ O. מעוקר
5. הפעל את מערכת זלוף לב, להתאים את הטמפרטורה באמבט המים וסירקולטור, לקבוע את המהירות של משאבת peristaltic עד 6 מיליליטר / דקה.
6. בועת KHB עם 95% O ₂גז / 5% CO _2, ולנטר את קצב זרימה ואת הטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס, על ידי בדיקה טמפרטורת סיבים אופטית) של השפכים. המערכת צריכה על 20 דקות לאיזון גז וטמפרטורה.

2. ההדמיה confocal של שרירי שלד בVivo

1. הרדימי עכבר עם pentobarbital (80 מ"ג / קילוגרם, ip). בעלי החיים יגיעו להרדמה כירורגית (אין תגובה לקמצוץ הבוהן) בתוך 10-15 דקות ולהישאר במצב זה עבור 1-1.5 שעות, מספיק לvivo ההדמיה של שרירי שלד.
2. להסיר שערות על אחד hindlimbs ולעקר את העור עם 70% אתנול.
3. עושה חתך בעור בצד החיצוני של האיבר כדי לחשוף את שרירי הגסטרוקנמיוס.
4. תרים epimysium בעדינות עם מלקחיים חדים ועושה חתך דרכו במספריים. בהמשך לנתח כדי להסיר את epimysium ולחשוף את סיבי השריר שמתחתיו.
5. לטעינת vivo של TMRM לתוך השלדשריר, כולל TMRM (500 ננומטר) בתמיסת מלח מאוזנת איזוטוני לטבול שרירים ל30 דקות ולאחר מכן לשטוף החוצה על ידי פתרון ללא חיווי.
6. שים את העכבר בצד שלה במיקרוסקופ confocal (Zeiss LSM 510) השלב ולרסן את האיבר האחורי במצב שרירי שלד החשוף פונים נגד coverslip שמהווה את החלק התחתון של החדר. Coverslip הוא בין רקמת השריר והמטרה ההפוכה (שמן 40X).
7. לחץ על הרגל בעדינות כדי ליצור קשר הדוק בין הרקמות וcoverslip. לטבול את השרירים החשופים בתמיסת מלח מאוזנת איזוטוני.
8. שיא שני (2D, XY) תמונות confocal ממדיות בקצב דגימה של שנייה אחת לכל מסגרת. האינטנסיביות של כל פיקסל דיגיטציה בעומק של 8 ביט. בדרך כלל, סריקה סידורי מכילה 100 מסגרות.
9. לאסוף תמונות רציפים על ידי ראשון מרגש ב405 ננומטר ואיסוף ב> 505 ננומטר אז ב488 ננומטר תוך איסוף ב> 505 ננומטר לexcitatio אורך גל כפולההדמיה n של MT-cpYFP. השתמש עירור רציף ב405, 488 ו543 ננומטר, ולאסוף פליטה ב 505-545, 505-545, ו> 560 ננומטר, בהתאמה, עבור הדמיה עירור גל משולשת של MT-cpYFP וTMRM.

3. ההדמיה confocal של לב perfused מאוס

1. מייד לאחר vivo ההדמיה של שרירי שלד, להזריק את העכבר עם 200 יחידות של הפרין (IP). עשר דקות מאוחר יותר, להרדים את העכבר על ידי פתיחת בית החזה ובמהירות להסיר את הלב עם ריאות ובלוטת התימוס קשורות אליו.
2. להסיר במהירות את הריאות במאגר קר כקרח. זהה את האונות של בלוטת התימוס ולקלף בעדינות לאחור כדי לחשוף את אב העורקים עולים.
3. הסר את בלוטת התימוס ולבודד את אב העורקים על ידי הסרת כל רקמה הסובבת בזהירות.
4. לעשות חתך בקצה העליון של אב העורקים עולים לפני הסניף הראשון של קשת אב העורקים.
5. החזק את הקיר של אב העורקים בעדינות עם שני מלקחיים תפירת מיקרו כדי לחשוף את לומן ומניח בזהירות את אב העורקים על cannula (PE50 צינור). אב העורקים הוא נערך במקום עם מהדק כלי מיקרו בזמן שתפרים קשורים במהירות ברחבי אב העורקים.
6. הסר את המהדק, לבדוק היטב את הצינורית עם מלקחיים כדי לוודא שהקצה של הצינורית הוא מעל שורש אב העורקים. קשרים נוספים מתווספים ככל שיידרשו כדי להחזיק את הלב במקום.
7. הפעל את משאבת peristaltic ותנקב לב ב1 מיליליטר / דקה. הלב יתחדש מכה על זלוף.
8. להתאים את המיקום של מערכת זלוף ולשים לב על הבמה מיקרוסקופ. יש שלב מתאם המאפשר חימום של החדר שמחזיק את הלב.
9. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת זלוף KHB בתא עד להטביע את הלב באופן חלקי. לפקח על טמפרטורה של החדר על 37 ° C. הסר את השפכים מהתא באמצעות משאבת peristaltic.
10. להגדיל את המהירות של משאבת peristaltic בהדרגה כדי לספק זרימה מספקת (כ 2 מיליליטר / דקה) ללב.
11. לאחר 10 דקות של התייצבות, תנקב heart עם 10 blebbistatin מיקרומטר ו100-500 TMRM ננומטר. פעימת לב תהיה להאט לאחר 10 דקות.
12. להפעיל לחץ עדין על הלב כדי להבטיח קשר הדוק של הלב עם coverslip בחלק התחתון של החדר ולדכא את פעימות לב נוסף.
13. בצע את אותו תהליך הדמיה confocal של שריר הלב שלם כמתואר בשלב 2.8 לעיל. להתאים את מישור המוקד בזהירות כדי לחשוף את התמונה הברורה ביותר האפשרית.

4. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

1. השתמש בכלים המסופקים על ידי מודול "פיזיולוגי ניתוח" של תוכנת confocal לנתח שינויי חום וקרום המיטוכונדריה בודדים פוטנציאליים. מודול זה נכלל לעתים קרובות בתוכנת תמונת רכישה של מערכת confocal ומאפשר קביעה של אזורים מסוימים בתמונה, כמו גם תפוקה של עוצמת הקרינה עם תוויות זמן.
2. פתח את מסד הנתונים ולאחר מכן את קובץ התמונה 2D הסידורי להיות מנותחת.
3. לחץ על "האזורשל העניין (ROI) אומר "כדי לעבור ל" ממוצע של ROIs" המצב. לחץ על "האזור של העניין (ROI) אומר" כדי לעבור למצב "אומר של ROIs".
4. לבטל את התצוגה של ערוצים אחרים מלבד ערוץ cpYFP 488 ננומטר לבחירת ההבזקים.
5. זום בתמונה באופן ידני להעביר פס שקף לשחק תמונות 2D סדרתי.
6. לזהות הבזקי סופראוקסיד המיטוכונדריה אחת על ידי איתור האתר שבו עליות אות ניאון transiently. השתמש בכלי ROI המתאים כדי לסמן את ההבזקים. העקבות מראים שינוי הקרינה תלוי זמן של כל החזר על השקעה תופיע לצד התמונה.
7. לאחר בחירת כל ההבזקים, להפעיל את התצוגה של ערוצים אחרים. בחר את ההחזר על ההשקעה על התמונה חיצונית של התא לחיסור אות רקע. פלט הקרינה הממוצעת של כל החזר על השקעה יחד עם תוויות הזמן.
8. רשום את מספר ההבזקים בכל אחד מקובץ תמונת הסריקה הסידורי יחד עם הזמן ושטח של הסריקההתא. השימוש ב-Excel כדי לחשב הבזק תדירות כמו מספר הבזקים לכל 100 שניות / שטח תא 1,000 מיקרומטר ^2.
9. השתמש בתכנית שפותחה במיוחד עבור כתובה בנתונים אינטראקטיביים שפה (IDL, ResearchSystems) כדי לחשב את הפרמטרים של כל פלאש (אמפליטודה, זמן להגיע לשיא וזמן דעיכה). תוכנת IDL היא זמינה באופן מסחרי וניתן לקבל את התכנית שפותחה במיוחד עבור ניתוח לבזק פרמטר מן המחבר על פי דרישה.

תוצאות

על פי פרוטוקול זה, in vivo הדמיה של אירועי המיטוכונדריה אחד יכולה לעשות בשרירי שלד של עכברים מורדמים ואחריו בהדמיה באתרו בלב perfused (איור 1). ההגדרה האופטימלית של תנאי ההדמיה תבטיח תמונות ברורות של רקמות שרירים ללא פגע ועם הרזולוציה mitochondrion אחד (איור ...

Discussion

יש הדמיה אירועי המיטוכונדריה אחת בחי או באיברי perfused יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות ^{ל17,19,21,22,24,25} הערכת תפקוד המיטוכונדריה. הטכניקה המתוארת כאן יכולה להשיג בזמן אמת בנחישות באתרו של תפקוד המיטוכונדריה במצב פיסיולוגי אמיתי ברזולוציה subcellular. התכונה זו שי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.