단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

요약

공 초점 주사 현미경은 살아있는 동물의 관류 심장이나 골격근에 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징에 적용된다. 수퍼 옥사이드 깜박이고 막 잠재적 인 변동으로 단일 미토콘드리아 프로세스의 실시간 모니터링은 생리학 관련 맥락에서 병리학 섭동 동안 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게한다.

초록

미토콘드리아는 진핵 세포 시스템의 에너지 생산과 세포 내 신호 전달을 담당하는 중요한 세포 내 소기관이다. 미토콘드리아 기능 장애는 종종 함께 인간의 질병에 기여한다. 미토콘드리아의 기능 장애를 평가하기 위해 개발 된 방법의 대부분은 시험 관내 또는 생체 측정에 기반하고 있습니다. 이 실험의 결과는 생체 내에서 미토콘드리아의 기능을 결정하는 능력을 제한했다. 여기서, 우리는 생체 내에서 실시간 방식으로 단일 미토콘드리아 기능의 평가를 허용 라이브 aminals있는 그대로 조직 이미징을 위해 공 초점 주사 현미경을 이용하는 신규 한 방식을 기술한다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 대상 슈퍼 옥사이드 표시, 원 순열 노란색 형광 단백질 (MT-cpYFP)를 발현하는 형질 전환 생쥐를 생성합니다. 마취 MT-cpYFP 마우스를 맞춤 제작 단계 어댑터와 시간 경과 이미지가 F를 촬영에 고정되어뒷다리의 노출 된 골격 근육을 롬. 마우스는 이후에 희생되고, 마음은 37 ℃에서 생리적 솔루션 랑겐 관류 설정 관류 마음은 공 초점 현미경의 무대에서 특별한 챔버에 위치하고 부드러운 압력은 마음을 고정화하고 심장 박동에 의한 동 잡음을 억제하기 위해 적용된다. 과산화물이 점멸 초당 프레임의 주파수에서 실시간 2D 공 촛점 이미징에 의해 감지됩니다. 관류 액은 다른 호흡 기질 또는 다른 형광 표시기를 포함하도록 수정 될 수있다. 관류 또한 허혈 및 재관류와 같은 질병 모델을 생성하기 위해 조정될 수있다. 이 기술은 본래 조직 및 생체 내 싱글 미토콘드리아의 기능을 결정하기위한 유일한 방법이다.

서문

미토콘드리아는 세포의 생체 에너지의 중심 역할, 자유 라디칼 신호, 산화 환원 항상성, 이온 조절하고, 세포의 운명 결정 ^{1,2을한다.} 미토콘드리아의 기능 장애는 종종 함께 질병 ^3-6의 병인의 기초. 특히 심장과 골격 근육과 근육 시스템에서, 미토콘드리아의 호흡은 세포 내 칼슘과 강력한 힘 개발 ^7,8의 적절한 조절을 지원하는 ATP의 대부분을 제공합니다. 이 근육들은 전체 세포 부피 20-40 %를 차지하며, 근육 섬 ² 사이에 "고정"하는 미토콘드리아의 큰 숫자를 가지고있다.

수많은 연구에도 불구하고, 특히 생체 내에서 생리 학적으로 관련된 조건에서 미토콘드리아 기능 조절, 우리의 이해는 제한되어 있습니다. 이유는 미토콘드리아의 기능을 평가하기 위해 개발 된 방법의 대부분 vitr에 의존하다O 또는 EX 인공 기질이 보충 된 절연 미토콘드리아의 산소 소비 및 형태학 통해서 미토콘드리아 기능의 간접 측정 (예를 들면 전자 현미경), 효소 활성 (예 aconitase 활성) 또는 세포 내 ATP 농도 ^9-11 모니터링과 같은 생체 내 접근법 .

최근 상대 미토콘드리아 농축 작은 분자 형광 표시는 그대로 세포의 막 전위, 칼슘과 반응 산소 종 (ROS), ^{11 ~ 13을} 포함하여 미토콘드리아 신호를 엿볼 제공하기 위해 적용되었습니다. 또한, 여러 녹색 형광 단백질 (GFP)의 산화 환원을 기반으로 ROS 지표 구획화 된 세포 내 산화 환원 ROS ^{14-16 신호의보다} 구체적인 평가를 달성하기 위해 개발되었다. 이 가운데, 우리는 유전자에 의해 코딩 슈퍼 옥사이드 표시, 원형 순열 노란색 형광 단백질 및 targete 개발미토콘드리아 (MT-cpYFP) ^17에 D 그것. MT-cpYFP는 515 nm에서 모두 방출 피크와 405 또는 488 nm에서 흥분 할 수있다. 488 nm의 여기에서의 발광은 시험 관내 및 생체 내 보정 ^17,18에서 이전에 도시 된 바와 같이 수퍼 옥사이드에 구체적 응답한다. 405 nm의 여기에서의 방출은 (다양한 조건에서 MT-cpYFP의 방출 및 여기 스펙트럼에 대한 자세한 정보는 참조 (17)의 그림 1 참조) 내부 통제로 사용됩니다. 시간 경과 공 촛점 이미징,이 표시가 그대로 세포의 단일 미토콘드리아에서 초과 산화물 깜박라는 이름의 슈퍼 옥사이드 생산 이벤트를, 파열 감지합니다. 초과 산화물의 플래시는 미토콘드리아 호흡, 첨부 과도 미토콘드리아 막 탈분극과 ROS 생산 ^{17 ~ 20의} 복합 함수 역할을합니다. 최근에, 우리는 pUC 계 - CAGGS-MT-cpYFP 벡터 C57/BL6 배경에 ^{(17, 19)를} 사용하여 팬 조직 MT-cpYFP 형질 전환 마우스를 생성하고 강한 발현을 확인했습니다심장, 골격 근육과 다른 조직 (그림 2)에서이 지표의 시온. 형질 전환 마우스는 요청 및 워싱턴 대학의 MTA 승인에 관심이 학술 조사를 위해 사용할 수 있습니다.

이 연구에서, 우리는 현장 랑겐 관류 마음에 슈퍼 옥사이드 깜박 영상뿐만 아니라 마취 MT-cpYFP 형질 전환 마우스 ^{(17, 19)의} 골격 근육에있는 플래시 이벤트의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다. 이 기술은 생리학 관련 조건이나 생체 ^{(21, 22)의} 단일 미토콘드리아 ROS 생산 이벤트의 실시간 모니터링을 할 수 있습니다. 그런 적절한 형광 표시기 막전위 및 칼슘 등의 기타 단일 미토콘드리아 매개 변수를 모니터링하는 시스템을 사용하는 것도 가능하다. 세포 내 이벤트 (예를 들면 칼슘 과도) 또는 심장 기능 (와 미토콘드리아 기능의 추가, 동시 또는 병렬 평가 예. 박출계수)이 달성 될 수있다. 이러한 허혈 및 재관류와 같은 병리학적인 섭동은 그대로 심근 단일 미토콘드리아 기능에 대한 응력의 영향을 평가하기 위해 관류 심장에 적용될 수있다.

프로토콜

1. 실험 준비

1. 140 밀리미터의 NaCl, 5 밀리미터의 KCl, 2.5 mM의 _{염화칼슘,} 2 mM의 _MgCl2를 10 mM의 HEPES 생체 골격 근육 이미징 (산도 7.2)이 포함 된 등장 균형 염 용액 (50 ㎖)을 준비합니다.
2. 118 밀리미터의 NaCl, 5.3 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 _망초, 0.5 mM의 EDTA, 25 mM의 _탄산 수소 _나트륨을 : 포함 크렙스 - Henseleit 버퍼 (KHB)의 1 L를 준비합니다.
3. 버블 함유 가스 95 % O ₂ / 5 _더 이전에 2 ㎜ _{염화칼슘을} 추가로 10 ~ 15 분 %의 CO ₂ KHB. 신진 대사 기판 (예를 들어, 10 mM의 포도당과 0.5 mM의 피루 베이트)를 추가합니다.
4. 70 % 에탄올에 클램프, 가위 및 집게를 살균하고 소독 DDH ₂ O.에서 세척하여 수술 도구를 준비합니다
5. 심장 관류 시스템을 켜고 물을 욕조 및 순환 장치의 온도를 조정, 6 ㎖ / 분으로 연동 펌프의 속도를 설정합니다.
6. 95 % O _2와 버블 KHB/ 5 % CO ₂ 가스, 폐수의 유량 (광섬유 온도 프로브에 의하여 37 ° C)의 온도를 모니터링한다. 이 시스템은 가스 온도 평형에 대해 20 분을 필요로한다.

2. 생체 내에서 골격 근육의 공 촛점 이미징

1. 펜토 바르 비탈 (80​​ ㎎ / kg, IP)으로 마우스를 마취. 동물은 10 ~ 15 분 이내에 수술 마취 (발가락 핀치에 대한 응답)에 도달과 골격 근육의 생체 내 이미징을위한 충분한 ~ 1.5 시간,이 상태로 유지됩니다.
2. 뒷다리 중 하나에 머리카락을 제거하고 70 % 에탄올로 피부를 소독.
3. 비복근 근육을 노출 사지의 외측을 따라 피부에 절개를합니다.
4. 날카로운 집게로 조심스럽게 epimysium를 들고 가위로를 통해 절개를합니다. 또한 epimysium를 제거하고 그 아래에 근육 섬유를 노출 해부.
5. 골격에 TMRM의 생체 로딩근육은 30 분 동안 근육을​​ 몰두하고 표시가없는 솔루션에 의해 세척 등장 균형 염 용액에 TMRM (500 nm의) 등이 있습니다.
6. 공 초점 현미경 (자이스 혈구 LSM 510) 무대에서 옆에 마우스를두고 노출 된 골격 근육은 챔버의 바닥을 형성하는 커버 슬립에 직면 위치에 뒤쪽 다리를 억제합니다. 커버 슬립은 근육 조직과 반전 목적 (40X 오일) 사이에있다.
7. 조직과 커버 슬립 간의 긴밀한 접촉을 부드럽게 아래로 다리를 누릅니다. 등장 균형 염 용액에 노출 된 근육을 담근다.
8. 프레임 당 1 초의 샘플링 속도에서 기록이 차원 (2D, XY) 공 촛점 이미지. 각 픽셀의 강도는 8 비트 깊이로 디지털화된다. 일반적으로, 연속 검사는 100 프레임이 포함되어 있습니다.
9. > 505 nm에서 처음으로 405 nm에서 흥분과 수집하여 순차 이미지를 수집 한 후 488 nm에서 이중 파장 excitatio에> 505 nm에서 수집하는 동안MT-cpYFP의 N 영상. MT-cpYFP과 TMRM의 트리플 파장 여기 영상에 대해 각각 405, 488 및 543 nm에서 순차적 여기를 사용하여, 505-545에서 505-545을 배출를 수집하고,> 560 nm의.

3. 관류 마우스 심장의 공 촛점 이미징

1. 즉시 골격근의 생체 촬상 후에, 헤파린 (IP)의 200 단위로 마우스를 주입. 십 분, 개흉술로 마우스를 안락사 빠르게에 연결된 폐, 흉선과 마음을 제거합니다.
2. 빨리 얼음처럼 차가운 버퍼에 폐를 제거합니다. 흉선의 엽 (叶)을 식별하고 부드럽게 상행 대동맥을 노출 다시 껍질.
3. 흉선을 제거하고주의 깊게 주변 조직을 제거하여 대동맥을 격리 할 것.
4. 대동맥의 첫 번째 분기 전에 상행 대동맥의 상단에 상처를 확인합니다.
5. 루멘을 노출하는 두 개의 마이크로 봉합 핀셋으로 조심스럽게 대동맥의 벽을 잡고 조심 캘리포니아에 대동맥을 배치nnula (PE50 튜브). 봉합이 빠르게 대동맥 주위에 연결되어있는 동안 대동맥은 마이크로 혈관 클램프와 장소에서 개최됩니다.
6. 정맥의 끝이 대동맥 루트를 확인하기 위해 집게와 캐 뉼러를주의 깊게 검사, 클램프를 제거합니다. 추가 관계는 장소에 마음을 잡고 필요에 따라 추가됩니다.
7. 연동 펌프의 전원을 켜고 / 분 1 ㎖에 마음을 perfuse. 심장 관류에 치고 다시 시작됩니다.
8. 관류 시스템의 위치를​​ 조정하고 현미경 무대에 마음을 넣어. 무대는 마음을 보유 챔버의 가열 수있는 어댑터가 있습니다.
9. 부분적으로 마음을 잠수함 챔버에 KHB 관류 용액 1 ㎖를 추가합니다. 37 ° C에서 챔버의 온도를 모니터링 연동 펌프를 사용하여 챔버로부터 유출 물을 제거한다.
10. 서서히 심장에 충분한 흐름을 (약 2 ml / 분)를 제공하는 연동 펌프의 속도를 높입니다.
11. 안정화의 10 분 후, 혜를 perfuse10 μM의 blebbistatin 및 100 ~ 500 nm의 TMRM과 RT. 심장 박동이 10 분 후에 속도가 느려집니다.
12. 챔버의 바닥에 커버 슬립과 마음의 밀착을 보장하기 위해 추가로 심장 박동을 억제하기 위해 심장에 부드러운 압력을 적용합니다.
13. 위의 단계 2.8에 설명 된대로 그대로 심근의 공 촛점 이미징에 대해 동일한 절차를 수행합니다. 가능한 한주의 깊게 깨끗한 이미지를 나타 내기 위해 초점 평면을 조정합니다.

4. 이미지 처리 및 데이터 분석

1. 하나의 미토콘드리아가 깜박이고 막 잠재적 인 변화를 분석 할 수있는 공 초점 소프트웨어의 "생리 학적 분석"모듈에서 제공하는 도구를 사용합니다. 이 모듈은 종종 공 초점 시스템의 화상 획득 소프트웨어에 포함 된 이미지의 특정 영역의 판정뿐만 아니라, 시간 라벨 형광 강도의 출력을 허용한다.
2. 데이터베이스 및 분석 할 후 시리얼 2D 이미지 파일을 엽니 다.
3. "지역을 클릭이자 (ROI)은 평균의 ROI "로 전환"을 의미의 의미의 ROI "모드"로 전환 "관심 영역 (ROI) 의미"모드.을 클릭합니다. "
4. 깜박 선택 cpYFP 488 ㎚의 채널을 제외한 다른 채널의 표시를 해제합니다.
5. 이미지의 수동 줌 직렬 2D 이미지를 재생하는 슬라이드 막대를 이동합니다.
6. 여기서 형광 신호의 증가는 일시적으로 사이트를 찾아서 단일 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드가 점멸을 확인합니다. 섬광을 표시하기 위해 적절한 투자 수익 (ROI) 도구를 사용합니다. 각각의 투자 수익 (ROI)의 시간에 따른 형광 변화를 나타내는 곡선은 이미지 옆에 표시됩니다.
7. 모든 섬광을 선택한 후, 다른 채널의 디스플레이를 켭니다. 배경 신호 감산에 대한 세포의 외부 이미지에 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 함께 시간 라벨 출력 각 ROI의 평균 형광을.
8. 스캔 시간과 지역과 함께 직렬 스캔 이미지 파일의 각 깜박이는 횟수를 기록세포. Excel을 사용하여 100 초 / 1,000 μm의 ² 셀 영역 당 섬광의 숫자로 플래시 주파수를 계산합니다.
9. 각 플래시 (진폭, 피크 시간과 소멸 시간)의 매개 변수를 계산하는 대화 형 데이터 언어 (IDL, ResearchSystems)로 작성된 사용자 정의 개발 한 프로그램을 사용하십시오. IDL 소프트웨어를 상업적으로 사용할 수 있으며 플래시 파라미터 분석을위한 사용자 개발 프로그램은 요청에 따라 저자에서 얻을 수 있습니다.

결과

이 프로토콜에 따라, 하나의 미토콘드리아 이벤트의 생체 내 이미징 마취 된 쥐의 골격근에서 수행 할 수있는 관류 마음에 현장 영상 (그림 1)으로 하였다. 이미징 조건의 최적의 설정은 그대로 근육 조직의 선명한 이미지를 보장하고 단일 미토콘드리아 해상도 (그림 2)와 함께합니다. TMRM은 종종 MT-cpYFP의 위치를 확인하는 데 사용됩니다 및 MT-cpYFP 신호...

토론

살아있는 동물이나 관류 장기 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징은 미토콘드리아의 기능 평가 ^{17,19,21,22,24,25에} 대한 기존의 방법에 비해 상당한 장점이있다. 여기에 설명 된 기술은 세포 내 해상도에서 실제의 생리 학적 상태에서 미토콘드리아 기능의 동일계 판정 실시간을 달성 할 수있다. 전신 생체 내 특정 기관 또는 세포 유형의 정상적인 기능의 미토콘드리아의 역할을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.