Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou<em&gt; In Vivo</em

Resumo

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Resumo

Mitocôndria é uma organela intracelular crítico responsável pela produção de energia e de sinalização intracelular em sistemas eucariotas. Disfunção mitocondrial, muitas vezes acompanha e contribui para a doença humana. Maioria das abordagens que têm sido desenvolvidas para avaliar a função mitocondrial e disfunção são baseados na produção in vitro ou ex vivo, as medições. Os resultados desses experimentos têm capacidade para determinar a função mitocondrial in vivo limitado. Aqui, descrevemos uma nova abordagem que utiliza microscopia confocal para a imagem de tecidos intactos em aminals ao vivo, o que permite a avaliação da função mitocondrial único de uma forma em tempo real in vivo. Em primeiro lugar, gerar camundongos transgênicos expressando o indicador de superóxido mitocondrial alvo, a proteína fluorescente amarela permuta circular (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiados mouse é fixo em um adaptador de estágio feito por encomenda e as imagens de lapso de tempo são tomadas from os músculos esqueléticos expostas do membro posterior. O mouse é posteriormente sacrificado eo coração está configurado para Langendorff perfusão com soluções fisiológicas a 37 ° C. O coração perfundido está posicionado em uma câmara especial no palco microscópio confocal e uma leve pressão é aplicada para imobilizar o coração e suprimir batimento cardíaco artefato movimento induzido. Superóxido flashes são detectados pelo tempo real de imagens 2D confocal com uma frequência de um quadro por segundo. A solução de perfusão podem ser modificadas para conter diferentes substratos de respiração ou outros indicadores fluorescentes. A perfusão pode também ser ajustado para produzir modelos de doenças tais como a isquemia e reperfusão. Esta técnica é uma abordagem única para a determinação da função de simples mitocôndria em tecidos intactos e in vivo.

Introdução

As mitocôndrias têm um papel central na bioenergética celular, sinalização de radicais livres, homeostase redox, regulação iônica e determinação do destino da célula ^1,2. As mitocôndrias disfunção muitas vezes acompanha e sustenta a patogênese de doenças ^3-6. Especialmente nos sistemas musculares, tais como o coração e músculos esqueléticos, respiração mitocondrial fornece a maior parte do ATP para apoiar a regulação atempada de cálcio intracelular e robusto ^7,8 desenvolvimento de força. Estes músculos possuem um grande número de mitocôndrias, que muitas vezes ocupam até 20-40% do volume total de células e são "fixos" entre miofilamentos ^2.

Apesar de numerosos estudos, a nossa compreensão da regulação da função mitocondrial, especificamente in vivo e em condições fisiologicamente relevantes, é limitado. Uma das razões é que a maioria dos métodos desenvolvidos para avaliar a função mitocondrial confiar em VITRo ou ex vivo abordagens, tais como monitoramento do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas suplementadas com substratos artificiais, ea determinação indireta da função mitocondrial através da morfologia (microscopia de elétrons, por exemplo), a atividade da enzima (por exemplo, atividade aconitase), ou os níveis de ATP intracelular ^9-11 .

Recentemente, pequenos indicadores fluorescentes molécula com enriquecimento relativo mitocondrial têm sido aplicados para fornecer um vislumbre dos sinais mitocondriais, incluindo o potencial de membrana, cálcio e espécies reativas de oxigênio (ROS), em células intactas ^11-13. Além disso, vários de proteína fluorescente verde (GFP) e indicadores redox baseado ROS foram desenvolvidos para obter uma avaliação mais específica do redox intracelular compartimentada ou ROS sinaliza ^14-16. Entre isto, foi desenvolvido um indicador geneticamente codificado superóxido, a proteína fluorescente amarela permutada circular, e targeted-lo para dentro da mitocôndria (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP pode ser excitado a 405 ou 488 nm, com dois picos de emissão de 515 nm. A emissão a 488 nm de excitação é especificamente responsivo a superóxido como mostrado pela anterior in vitro e in vivo calibrações ^17,18. A emissão a 405 nm de excitação é utilizado como controle interno (consulte a Figura 1 da Ref. 17 para obter informações detalhadas sobre os espectros de emissão e excitação de mt-cpYFP sob várias condições). Com time-lapse confocal de imagem, este indicador detecta estourando eventos produção de superóxido dismutase, nomeado flashes, em mitocôndrias isolados de células intactas. Flash Superoxide serve como uma função composta de respiração mitocondrial, a despolarização da membrana mitocondrial transitória acompanhamento e produção de ROS ^17-20. Recentemente, gerou os pan-tecido mt-cpYFP camundongos transgênicos usando o vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP ^17,19 em C57/BL6 fundo e verificar as expressões fortesção deste indicador no coração, músculos esqueléticos e outros tecidos (Figura 2). Os camundongos transgênicos estarão disponíveis para os investigadores acadêmicos interessados ​​mediante solicitação e aprovação MTA pela Universidade de Washington.

Neste estudo, descrevemos em imagem in situ de superóxido flashes em Langendorff coração perfundido, bem como in vivo de imagens de eventos de flash em músculos esqueléticos de camundongos transgênicos mt-cpYFP anestesiados ^17,19. Esta tecnologia permite o monitoramento em tempo real de eventos de produção ROS único mitocondrial em uma condição fisiologicamente relevante ou in vivo ^21,22. Também é possível usar o sistema para controlar outros parâmetros individuais mitocondriais, tais como o potencial de membrana e de cálcio com indicadores fluorescentes adequadas. Avaliação Além disso, simultânea ou paralela da função mitocondrial com eventos intracelulares (por exemplo, transientes de cálcio) ou de função cardíaca (por exemplo,. Fração de ejeção) pode ser alcançado. Perturbações patológicas, tais como a isquemia e reperfusão, pode ser aplicada ao coração perfundido para avaliar o impacto do stress sobre a função mitocondrial único no miocárdio intacta.

Protocolo

1. Experiência Preparação

1. Preparar a solução isotónica salina equilibrada (50 ml) contendo: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM CaCl _2, 2 mM MgCl ₂ e 10 mM de HEPES (pH 7,2) para a visualização in vivo do músculo esquelético.
2. Prepare 1 litro de tampão de Krebs-Henseleit (KHB) contendo: NaCl 118 mM, KCl 5,3 mM, _MgSO4 1,2 mM, EDTA 0,5 mM e 25 mM de _NaHCO3.
3. Bolha KHB com gás contendo 95% _de O2 / 5% de CO ₂ durante 10-15 minutos antes da adição de 2 mM de _CaCl2. Adicionar substratos metabólicos (por exemplo, 10 mM de glucose e 0,5 mM de piruvato).
4. Prepare os instrumentos cirúrgicos com a esterilização a braçadeira, tesouras e fórceps em etanol 70% e, em seguida, enxaguar em esterilizado DDH ₂ O.
5. Ligue o sistema de perfusão do coração, ajustar a temperatura do banho de água e circulador, defina a velocidade da bomba peristáltica a 6 ml / min.
6. Bolha KHB com 95% _de O2/ 5% de CO ₂ de gás, e controlar a taxa de fluxo e temperatura (37 ° C, por uma sonda de temperatura de fibra óptica) do efluente. O sistema precisa de cerca de 20 min para o gás ea temperatura de equilíbrio.

2. Imagem confocal dos músculos esqueléticos Em Vivo

1. Anestesiar rato com pentobarbital (80 mg / kg, ip). O animal vai chegar a anestesia cirúrgica (sem resposta aos pés pitada) dentro de 10-15 min e permanecer neste estado por 1-1,5 h, suficiente para o vivo de imagens em dos músculos esqueléticos.
2. Retire os pêlos em um dos membros posteriores e esterilizar a pele com etanol a 70%.
3. Realizar uma incisão na pele ao longo do lado exterior do membro de expor os músculos gastrocnemius.
4. Pegue o epimísio delicadamente com uma pinça afiada e fazer uma incisão através dela com uma tesoura. Além disso dissecar para remover o epimísio e expor as fibras musculares por baixo.
5. Para in vivo carregamento de TMRM no esqueléticomuscular, incluem TMRM (500 nM) em solução de sal equilibrada isotónica imergir músculo durante 30 minutos e, em seguida lavar com uma solução isenta de indicador.
6. Colocar o rato sobre o seu lado no microscópio confocal (Zeiss LSM 510) fase e restringir o membro posterior em uma posição em que o músculo esquelético é exposta virada contra a lamela que forma o fundo da câmara. A lamela é entre o tecido muscular e o objectivo invertido (óleo de 40X).
7. Pressione a perna para baixo com cuidado para fazer contato apertado entre o tecido ea lamela. Mergulhe os músculos expostos em solução salina balanceada isotônica.
8. Grave duas dimensões (2D, xy) imagens confocal, a uma taxa de amostragem de um segundo por quadro. A intensidade de cada pixel é digitalizado em profundidade de 8 bits. Normalmente, uma varredura de série contém 100 quadros.
9. Coletar imagens seqüenciais por primeiro emocionante a 405 nm e coleta de> 505 nm a 488 nm, em seguida, durante a coleta de> 505 nm de comprimento de onda para a dupla excitation imagens de mt-cpYFP. Use excitação seqüencial a 405, 488 e 543 nm, e recolher emissão em 505-545, 505-545 e> 560 nm, respectivamente, para o triplo do comprimento de onda de excitação de imagem de mt-cpYFP e TMRM.

3. Imagem confocal de perfusão Rato Coração

1. Imediatamente após o vivo de imagens em dos músculos esqueléticos, injetar o mouse com 200 unidades de heparina (ip). Dez minutos depois, a eutanásia o mouse por toracotomia e rapidamente remover o coração com os pulmões eo timo ligadas a ele.
2. Remover rapidamente o pulmão em tampão gelado. Identificar os lóbulos do timo e suavemente descascar para trás para expor a aorta ascendente.
3. Remover o timo e isolar da aorta com cuidado de remover todo o tecido circundante.
4. Faça um corte na extremidade superior da aorta ascendente antes do primeiro ramo do arco aórtico.
5. Segurar a parede da aorta com cuidado com duas pinças de micro sutura para expor o lúmen e colocar cuidadosamente a aorta para o cannula (PE50 tubo). A aorta é mantida no lugar com uma pinça micro navio enquanto as suturas são rapidamente amarrado ao redor da aorta.
6. Retire o grampo, verifique cuidadosamente a cânula com uma pinça para garantir que a ponta da cânula está acima da raiz da aorta. Laços adicionais são adicionados como necessário para manter o coração no lugar.
7. Ligar a bomba peristáltica e perfundir o coração a 1 ml / min. O coração vai continuar batendo em perfusão.
8. Ajuste a posição do sistema de perfusão e colocar o coração no palco microscópio. A fase tem um adaptador que permite o aquecimento da câmara que contém o coração.
9. Adicionar 1 ml de solução de perfusão KHB na câmara para submergir parcialmente o coração. Monitorizar a temperatura da câmara a 37 ° C. Retirar efluente da câmara usando uma bomba peristáltica.
10. Aumentar a velocidade de bomba peristáltica gradualmente para fornecer fluxo suficiente (aproximadamente 2 ml / min) para o coração.
11. Após 10 minutos de estabilização, perfundir o heart com 10 uM e blebbistatin 100-500 nM TMRM. Batimento cardíaco vai abrandar depois de 10 min.
12. Aplicar uma leve pressão sobre o coração para assegurar um contacto apertado do coração com a lamela na parte inferior da câmara, e para suprimir ainda mais batimentos cardíacos.
13. Siga o mesmo procedimento para a imagem confocal de miocárdio íntegro, como descrito no passo 2.8 acima. Ajustar cuidadosamente o plano focal para revelar a imagem mais nítida possível.

4. Processamento de Imagem e Análise de Dados

1. Use as ferramentas fornecidas pelo módulo "Análise fisiológica" do software confocal para analisar único mitocondriais flashes e membrana possíveis mudanças. Este módulo é freqüentemente incluída na imagem adquirir software do sistema confocal e permite a determinação de certas áreas da imagem, bem como a saída de intensidade de fluorescência com rótulos de tempo.
2. Abra o banco de dados e, em seguida, o arquivo de imagem 2D de série a ser analisado.
3. Clique no botão "Regiãode interesse (ROI) significa "para mudar para a" média de ROIs "mode. Clique no botão" região de interesse (ROI) significa "para mudar para o" modo média de ROI ".
4. Desative a exibição de outros canais, exceto o canal de cpYFP 488 nm para a seleção dos flashes.
5. Aumentar a imagem e manualmente mover barra deslizante para reproduzir as imagens em 2D série.
6. Identificar único superóxido mitocondrial flashes por localizar o local onde sinais fluorescentes aumenta transitoriamente. Use a ferramenta ROI apropriado para marcar os flashes. O traço mostrando dependente do tempo a mudança de fluorescência de cada ROI vai aparecer ao lado da imagem.
7. Depois de selecionar todos os flashes, ligue a exibição de outros canais. Selecione um ROI na imagem exterior da célula para o sinal de subtração de fundo. Saída da fluorescência média de cada ROI juntamente com as etiquetas de tempo.
8. Registre o número de flashes em cada um dos arquivos de imagem de varredura de série juntamente com o tempo ea área de varreduraa célula. Use o Excel para calcular a frequência de flash como número de flashes por 100 seg / 1000 um ² Área ^do celular.
9. Use um programa desenvolvido sob medida escrito em Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) para calcular os parâmetros de cada Flash (amplitude, tempo de pico e tempo de decaimento). Software IDL está disponível comercialmente eo programa desenvolvido sob medida para a análise de parâmetros de flash pode ser obtida a partir do autor, mediante solicitação.

Resultados

De acordo com este protocolo, imagem in vivo de eventos mitocondriais único pode ser feito em músculos esqueléticos de ratos anestesiados, seguido por em imagem situ no coração perfusão (Figura 1). A configuração ideal das condições de imagem garante imagens nítidas dos tecidos musculares intactas e com resolução mitocôndria única (Figura 2). TMRM é muitas vezes usado para verificar a localização de mt-cpYFP e deve apresentar um padrão de so...

Discussão

Imagiologia eventos mitocondriais individuais em animal vivo ou órgãos perfundidos tem vantagem significativa em relação aos métodos tradicionais de avaliação da função mitocondrial ^{17,19,21,22,24,25.} A técnica aqui descrita pode realizar em tempo real a determinação in situ da função mitocondrial em condições fisiológicas reais na resolução subcelular. Isto é particularmente útil, quando combinada com outras medidas, para estudar sistematicamente o papel da mitocôndria...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.