Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em&gt; In Vivo</em

Riepilogo

La microscopia confocale a scansione viene applicato per l'imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.

Abstract

Mitocondrio è un organello intracellulare critico responsabile per la produzione di energia e di segnalazione intracellulare nei sistemi eucarioti. Disfunzione mitocondriale spesso accompagna e contribuisce alla malattia umana. La maggior parte dei metodi che sono stati sviluppati per valutare la funzione mitocondriale e la disfunzione si basano su in vitro o ex vivo misurazioni. I risultati di questi esperimenti hanno limitato la capacità di determinare la funzione mitocondriale in vivo. Qui, descriviamo un nuovo approccio che utilizza la microscopia confocale a scansione per l'imaging di tessuti intatti in aminals vivi, che permette di valutare singola funzione mitocondriale in maniera tempo reale in vivo. In primo luogo, generiamo topi transgenici che esprimono la mitocondriale mirato indicatore superossido, proteina fluorescente giallo circolarmente permutato (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestetizzato mouse è fissato su una scheda palcoscenico su misura e time-lapse immagini sono prese fRom muscoli scheletrici esposte del arti posteriori. Il mouse viene successivamente sacrificato e il cuore è impostato per Langendorff perfusione con soluzione fisiologica a 37 ° C. Il cuore perfuso è posizionato in una camera speciale sul palco microscopio confocale e leggera pressione viene applicata per immobilizzare il cuore e sopprimere battito cardiaco indotto artefatti da movimento. Superossido lampi vengono rilevati mediante real-time confocale 2D immagini ad una frequenza di un fotogramma al secondo. La soluzione di perfusione può essere modificata per contenere diversi substrati respiratori o altri indicatori fluorescenti. La perfusione può anche essere regolata per produrre modelli di malattie come l'ischemia e riperfusione. Questa tecnica è un approccio unico per la determinazione della funzione di singolo mitocondrio in tessuti normali e in vivo.

Introduzione

I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella bioenergetica di cellule, di segnalazione dei radicali liberi, redox omeostasi, regolazione ione, e il destino delle cellule determinazione ^1,2. La disfunzione dei mitocondri spesso accompagna e sottende la patogenesi delle malattie ^3-6. Soprattutto nei sistemi muscolari come il cuore e nei muscoli scheletrici, respirazione mitocondriale fornisce la maggior parte di ATP per sostenere regolamentazione tempestiva di calcio intracellulare e robusto ^7,8 sviluppo della forza. Questi muscoli in possesso di un gran numero di mitocondri, che spesso occupano fino al 20-40% del volume cellulare totale e sono "corretti" tra miofilamenti ^2.

Nonostante i numerosi studi, la nostra comprensione della regolazione della funzione mitocondriale, in particolare in vivo e in condizioni fisiologicamente rilevanti, è limitata. Uno dei motivi è che la maggior parte dei metodi sviluppati per valutare la funzione mitocondriale contare su di Vitroo approcci ex vivo, quali il monitoraggio del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, completata con substrati artificiali, e la determinazione indiretta della funzionalità mitocondriale mediante la morfologia (ad esempio microscopia elettronica), l'attività enzimatica (ad esempio attività aconitasi), o livelli di ATP intracellulari ^9-11 .

Recentemente, piccoli indicatori fluorescenti molecola con relativa arricchimento mitocondriale sono stati applicati per fornire un assaggio dei segnali mitocondriali, tra cui il potenziale di membrana, di calcio e di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in cellule intatte ^11-13. Inoltre, vari proteina fluorescente verde (GFP) basato redox e ROS indicatori sono stati sviluppati per ottenere una valutazione più specifica del redox intracellulare compartimenti o segnali ROS ^14-16. Tra questo, abbiamo sviluppato un indicatore geneticamente codificato superossido, la proteina fluorescente gialla permutato circolare, e targeted in mitocondri (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP può essere eccitato a 405 o 488 nm con entrambi i picchi di emissione a 515 nm. L'emissione a 488 nm di eccitazione è specificamente rispondenti a superossido come mostrato dalla precedente in vitro e in vivo calibrazioni ^17,18. L'emissione a 405 nm di eccitazione viene utilizzato come controllo interno (si veda la Figura 1 di Ref 17 per informazioni dettagliate sulle emissioni di eccitazione e spettri di mt-cpYFP in varie condizioni). Con il time-lapse imaging confocale, questo indicatore rileva scoppio eventi di produzione di superossido, chiamato superossido lampi, in singoli mitocondri delle cellule intatte. Superossido in flash serve come una funzione composta di respirazione mitocondriale, accompagnamento transitoria depolarizzazione della membrana mitocondriale e la produzione di ROS ^17-20. Recentemente, abbiamo generato i pan-tessuto mt-cpYFP topi transgenici con il vettore pUC-CAGGS-mt-cpYFP ^17,19 su C57/BL6 sfondo e verificato le forti espressionisione di questo indicatore nel cuore, muscoli scheletrici e altri tessuti (Figura 2). I topi transgenici sarà disponibile per ricercatori accademici interessati su richiesta e approvazione MTA dall'Università di Washington.

In questo studio, descriviamo in situ imaging lampeggia superossido in Langendorff cuore perfuso e immagini in vivo di eventi flash nella muscoli scheletrici di anestetizzati mt-cpYFP topi transgenici ^17,19. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale dei singoli eventi mitocondriali di produzione di ROS in una condizione fisiologicamente rilevanti o in vivo ^21,22. È anche possibile utilizzare il sistema per monitorare altri parametri singoli mitocondriali come potenziale di membrana e calcio con indicatori fluorescenti appropriati. Valutazione ulteriore, simultanea o parallela della funzione mitocondriale con eventi intracellulari (ad esempio transienti di calcio) o funzione cardiaca (ad esempio. Frazione di eiezione) può essere raggiunto. Perturbazioni patologiche, quali ischemia e riperfusione, possono essere applicati al cuore perfuso per valutare l'impatto dello stress sulla singola funzione mitocondriale nel miocardio intatta.

Protocollo

1. Esperimento Preparazione

1. Preparare la soluzione isotonica salina bilanciata (50 ml) contenente: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 2 mM MgCl ₂ e HEPES 10 mM (pH 7,2) per imaging in vivo muscolo scheletrico.
2. Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KHB) contenente: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 MgSO mm _4, EDTA 0,5 mm e 25 NaHCO mm _3.
3. Bubble il KHB con gas contenente 95% O _2/5% di CO ₂ per 10-15 minuti prima dell'aggiunta di 2 mM CaCl _2. Aggiungi substrati metabolici (glucosio ad esempio 10 mm e piruvato 0,5 mm).
4. Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzando la pinza, forbici e pinze in etanolo al 70% e poi risciacquo in sterilizzata DDH ₂ O.
5. Accendere il sistema di perfusione cardiaca, regolare la temperatura su bagnomaria e circolatore, impostare la velocità della pompa peristaltica di 6 ml / min.
6. Bubble il KHB con il 95% O ₂/ 5% CO ₂ gas, e il controllo della portata e della temperatura (37 ° C, da una sonda di temperatura a fibre ottiche) dell'acqua residua. Il sistema necessita di circa 20 minuti per il gas e temperatura di equilibrazione.

2. Imaging confocale dei muscoli scheletrici In Vivo

1. Anestetizzare mouse con pentobarbital (80 mg / kg, ip). L'animale raggiungerà anestesia chirurgica (nessuna risposta al pinch tep) entro 10-15 minuti e rimane in questo stato per 1-1,5 ore, sufficiente per l'imaging in vivo dei muscoli scheletrici.
2. Rimuovere peli su una delle zampe posteriori e sterilizzare la pelle con etanolo al 70%.
3. Fare un'incisione sulla pelle lungo il lato esterno dell'arto per esporre i muscoli gastrocnemio.
4. Sollevare il epimisio delicatamente con una pinza taglienti e fare un'incisione attraverso di essa con le forbici. Ulteriore sezionare per rimuovere il epimisio ed esporre le fibre muscolari sotto di esso.
5. Per il carico in vivo di TMRM nel scheletricomuscolare, includono TMRM (500 nM) in soluzione isotonica salina bilanciata di immergere muscolare per 30 minuti e poi lavare con una soluzione priva di indicatore.
6. Posizionare il mouse su un lato con il microscopio confocale (Zeiss LSM 510) stadio e trattenere l'arto posteriore in una posizione che il muscolo scheletrico esposta sia rivolta contro il coprioggetto che forma il fondo della camera. Il vetrino è tra il tessuto muscolare e l'obiettivo invertita (olio 40X).
7. Premere la gamba delicatamente verso il basso per rendere stretto contatto tra il tessuto e il vetrino. Immergere i muscoli esposti in soluzione isotonica salina bilanciata.
8. Record bidimensionali (2D, xy) le immagini confocale ad una frequenza di campionamento di un secondo per fotogramma. L'intensità di ciascun pixel viene digitalizzato in profondità di 8-bit. Di solito, una scansione seriale contiene 100 fotogrammi.
9. Raccogliere immagini sequenziali di primo emozionante a 405 nm e la raccolta a> 505 nm poi a 488 nm, mentre la raccolta a> 505 nm per doppia lunghezza d'onda excitation imaging mt-cpYFP. Utilizzare eccitazione sequenziale a 405, 488 e 543 nm, e raccogliere emissione a 505-545, 505-545 e> 560 nm, rispettivamente, per tre lunghezze d'onda di eccitazione imaging mt-cpYFP e TMRM.

3. Imaging confocale di cuore perfuso mouse

1. Subito dopo imaging in vivo dei muscoli scheletrici, iniettare il mouse con 200 unità di eparina (ip). Dieci minuti dopo, eutanasia il mouse toracotomia e rapidamente rimuovere il cuore con i polmoni e timo collegato ad esso.
2. Rimuovere rapidamente il polmone in tampone ghiacciato. Identificare i lobi del timo e la buccia delicatamente per esporre l'aorta ascendente.
3. Rimuovere il timo e isolare l'aorta rimuovendo accuratamente qualsiasi tessuto circostante.
4. Effettuare un taglio all'estremità superiore della aorta ascendente prima del primo ramo della dell'arco aortico.
5. Tenere la parete dell'aorta delicatamente con due pinze sutura micro per esporre il lume e posizionare accuratamente l'aorta sulla cannula (PE50 tubo). L'aorta è tenuto in posizione con un morsetto nave micro mentre suture vengono rapidamente legato intorno all'aorta.
6. Rimuovere la fascetta, controllare attentamente la cannula con una pinza per assicurarsi che la punta della cannula è al di sopra della radice aortica. Legami vengono aggiunti se necessario per tenere il cuore a posto.
7. Accendere la pompa peristaltica e profumato cuore a 1 ml / min. Il cuore riprende a battere su di perfusione.
8. Regolare la posizione del sistema di perfusione e mettere il cuore sul palco microscopio. Lo stadio ha un adattatore che permette il riscaldamento della camera che contiene il cuore.
9. Aggiungere 1 ml di soluzione di perfusione KHB nella camera di immergere parzialmente cuore. Controllo della temperatura della camera a 37 ° C. Rimuovere effluenti dalla camera utilizzando una pompa peristaltica.
10. Aumentare la velocità della pompa peristaltica gradualmente per fornire un flusso sufficiente (circa 2 ml / min) al cuore.
11. Dopo 10 min di stabilizzazione, profumato il heart con 10 micron blebbistatin e 100-500 nM TMRM. Battito cardiaco rallenta dopo 10 min.
12. Applicare una leggera pressione sul cuore per assicurare stretto contatto del cuore con il coprioggetto sul fondo della camera e per sopprimere ulteriormente battito cardiaco.
13. Seguire la stessa procedura per l'imaging confocale di miocardio intatto come descritto nel precedente punto 2.8. Regolare accuratamente il piano focale per rivelare l'immagine più chiara possibile.

4. Image Processing e Analisi dei Dati

1. Utilizzare gli strumenti forniti dal modulo "Analisi fisiologica" del software confocale per analizzare singoli mitocondriali lampeggia e membrana potenziali cambiamenti. Questo modulo è spesso incluso nel software di acquisizione di immagini del sistema confocale e permette la determinazione di certe aree dell'immagine così come uscita di intensità di fluorescenza con etichette temporali.
2. Aprire il database e quindi il file immagine 2D di serie da analizzare.
3. Fare clic su "Regioned'interesse (ROI) significa "per passare al" media di ROI "mode. Clicca sul" regione di interesse (ROI) significare "per passare alla modalità" media del ROI ".
4. Disattivare la visualizzazione di altri canali, tranne il canale di cpYFP 488 nm per la selezione dei lampi.
5. Zoom a immagine e spostare manualmente barra di scorrimento per riprodurre le immagini 2D seriali.
6. Identificare i singoli mitocondriali superossido lampeggia individuando il luogo in cui gli aumenti segnale fluorescente transitoriamente. Utilizzare lo strumento ROI adeguato per contrassegnare i flash. La traccia mostrando tempo-dipendente variazione di fluorescenza di ogni ROI apparirà accanto all'immagine.
7. Dopo aver selezionato tutti i flash, attivare la visualizzazione di altri canali. Selezionare un ROI sull'immagine all'esterno della cellula per segnale sottrazione del fondo. Uscita la fluorescenza media di ogni ROI insieme alle etichette temporali.
8. Registrare il numero di lampeggi in ciascuno dei file immagine di scansione seriale con il tempo di scansione e l'area dila cella. Utilizzare Excel per calcolare la frequenza flash come numero di lampi per 100 sec / 1,000 micron ² superficie cellulare.
9. Utilizzare un programma personalizzato sviluppato scritto in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) per calcolare i parametri di ogni flash (ampiezza, tempo al picco e tempo di decadimento). Software IDL è disponibile in commercio e il programma personalizzato sviluppato per analisi parametro flash può essere ottenuta dall'autore su richiesta.

Risultati

Secondo questo protocollo, imaging in vivo di eventi mitocondriali singoli può essere realizzata in muscoli scheletrici di topi anestetizzati, seguita da in situ imaging cuore perfuso (Figura 1). La regolazione ottimale delle condizioni di imaging garantisce immagini chiare dei tessuti muscolari intatte e con una risoluzione singolo mitocondrio (Figura 2). TMRM viene spesso utilizzato per verificare la posizione del mt-cpYFP e dovrebbe mostrare un pattern completa sov...

Discussione

Imaging eventi mitocondriali singoli organi irrorati di animali vivi o ha un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali di valutazione della funzione mitocondriale ^{17,19,21,22,24,25.} La tecnica qui descritta può realizzare in tempo reale in situ determinazione della funzionalità mitocondriale in una condizione fisiologica reale alla risoluzione subcellulare. Ciò è particolarmente utile, quando combinato con altre misurazioni, per studiare sistematicamente il ruolo dei mitocondri nel ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.