Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Özet

Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Mitokondri ökaryotik sistemlerde enerji üretimi ve hücre içi sinyal sorumlu kritik bir hücre içi organel. Mitokondriyal işlev bozukluğu, genellikle eşlik eden ve insan hastalığına neden olur. Mitokondriyal işlev bozukluğu ve değerlendirmek için geliştirilmiştir yaklaşımlar çoğunluğu in vitro ya da ex vivo ölçümler dayanmaktadır. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar, in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonu belirlenmesinde yeteneği sınırlıdır. Burada, in vivo olarak, gerçek zamanlı bir şekilde, tek bir mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanır, canlı aminaller sağlam dokuların görüntülenmesi için, konfokal tarama mikroskobu kullanan yeni bir yaklaşımı tarif eder. İlk olarak, mitokondriyal hedeflenen süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan proteini (mt-cpYFP) ifade eden transjenik fareler üretir. Anestezi mt-cpYFP fare ısmarlama bir sahne adaptörü ve zaman atlamalı görüntüler f alınır sabittirhindlimb açıkta kalan iskelet kasları rom. Fare daha sonra kurban edilir ve kalp 37 ° C'de fizyolojik çözümleri ile Langendorff perfüzyon için ayarlanmış Perfüze kalp konfokal mikroskop sahnede özel bir odasında konumlandırılmış ve hafif basınç kalp hareketsiz ve kalp atışını kaynaklı hareket yapaylığı bastırmak için uygulanır. Süperoksit yanıp saniyede bir çerçeve frekansında gerçek zamanlı 2D konfokal görüntüleme ile tespit edilir. Perfüzyon çözüm farklı alt tabakaların solunum ya da diğer floresan göstergeleri ihtiva edecek şekilde modifiye edilebilir. Perfüzyon, aynı zamanda, iskemi ve reperfüzyon gibi hastalık modeller üretmek için ayarlanabilir. Bu teknik, sağlam dokularda ve in vivo olarak bir mitokondri fonksiyonunu belirlemek için benzersiz bir yaklaşımdır.

Giriş

Mitokondri hücre Bioenerji merkezi rol, serbest radikal sinyalizasyon, redoks hemostazını, iyon düzenlenmesi ve hücre kaderinin belirlenmesi ^1,2 oynamaktadır. Mitokondri disfonksiyon sıklıkla eşlik eder ve hastalık ^3-6 patogenezi yatmaktadır. Özellikle bu kalp ve iskelet kasları gibi kas sistemlerinde, mitokondriyal solunum hücre içi kalsiyum ve sağlam, güç geliştirme ^7,8 zamanında düzenleme desteklemek için ATP çoğunluğu içerir. Bu kaslar, genellikle, toplam hücre hacmi% 20-40 kadar işgal myofilaments ² arasında "sabit" olan mitokondri içinde çok sayıda sahiptirler.

Çok sayıda araştırmaya rağmen, özellikle in vivo ve fizyolojik ilgili koşullar altında mitokondriyal fonksiyon yönetmelik, anlayışımız, sınırlıdır. Bunun nedenlerinden biri, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemlerin çoğunluğu vitr olarak itimato ya da eski tür yapay substratlar ile takviye izole mitokondri oksijen tüketimi ve morfoloji yoluyla mitokondriyal fonksiyonun belirlenmesi dolaylı (örneğin elektron mikroskopisi), enzim aktivitesi (örneğin akonitaz aktivite) ya da hücre içi ATP seviyeleri ^9-11 izlenmesi gibi vivo yaklaşımlar, .

Son zamanlarda, göreceli mitokondriyal zenginleştirme ile küçük molekül floresan göstergeler sağlam hücrelerde zar potansiyeli, kalsiyum ve reaktif oksijen türlerinin (ROS), dahil olmak üzere ^11-13 mitokondriyal sinyallerin bir belirti sağlamak için uygulanmıştır. Ayrıca, çok sayıda yeşil floresan protein (GFP) redoks bazlı ve ROS göstergeleri bölümlere hücre içi redoks veya ROS ^14-16 sinyal daha özel bir değerlendirme elde etmek için geliştirilmiştir. Bu arasında, bir genetik olarak kodlanmış süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan protein ve targete gelişmişmitokondri (mt-cpYFP) ¹⁷ içine d o. mt-cpYFP 515 nm 'de iki emisyon tepe ile 405 ya da 488 nm'de uyarıldığında edilebilir. 488 nm eksitasyon emisyon in vitro ve in vivo kalibrasyon ^17,18 önceki ile gösterildiği gibi, süperoksit özellikle duyarlıdır. 405 nm uyarma emisyon (çeşitli koşullar altında mt-cpYFP emisyon ve uyarma spektrumları hakkında detaylı bilgi için Ref 17 Şekil 1'e bakınız), iç kontrol olarak kullanılmıştır. Time-lapse konfokal görüntüleme ile bu gösterge sağlam hücreler tek mitokondrilerinde süperoksit yanıp adlı süperoksit üretimi olayları, patlama algılar. Süperoksit flaş mitokondrial solunum, ekli geçici mitokondriyal membran depolarizasyon ve ROS üretiminin ^17-20 bir bileşik fonksiyonu olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda, biz pUC'den CAGGS-mt-cpYFP vektör C57/BL6 arka planda ^17,19 kullanarak pan-doku mt-cpYFP transgenik fareler üretilen ve güçlü Expres doğruladıktankalp, iskelet kasları ve diğer dokularda (Şekil 2) Bu göstergenin sion. Transgenik fareler istek ve Washington Üniversitesi tarafından MTA onayıyla ilgilenen akademik araştırmacılar için geçerli olacak.

Bu çalışmada, in situ Langendorff perfüze kalp süperoksit basmaları görüntüleme gibi anestezi uygulanmış mt-cpYFP transgenik farelerin ^17,19 iskelet kaslarında flaş etkinlikleri in vivo görüntüleme açıklar. Bu teknoloji fizyolojik ilgili bir durum veya in vivo ^21,22 tek mitokondriyal ROS üretim olayları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Böyle uygun floresan gösterge ile membran potansiyeli ve kalsiyum gibi diğer tek mitokondriyal parametrelerini izlemek için sistemi kullanmak da mümkündür. Hücre içi olaylar (örn. kalsiyum geçici) veya kalp fonksiyonu (mitokondriyal fonksiyonu daha fazla, aynı anda ya da paralel değerlendirme örn.. Ejeksiyon fraksiyonu) elde edilebilir. Böyle iskemi reperfüzyon gibi patolojik tedirginlikler, sağlam miyokardiyumda tek mitokondriyal fonksiyonu üzerindeki stresin etkisini değerlendirmek için perfüze kalp uygulanabilir.

Protokol

1.. Deney Hazırlama

1. 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM _CaCl2, 2 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, in vivo görüntüleme için iskelet kası (pH 7.2) ihtiva eden izotonik bir dengelenmiş tuz çözeltisi (50 ml) hazırlayın.
2. 118 mM NaCI, 5.3 mM KCI, 1.2 mM MgSO _4, 0.5 mM EDTA ve 25 mM NaHCO _3: içeren Krebs-Henseleit tamponu (KHB) 1 L hazırlayın.
3. Kabarcık gaz ihtiva eden% 95 O _5/2 önceden 2 mM _CaCl2 eklenmesinden 10-15 dakika boyunca% _CO2 ile KHB. Metabolik substratlar (örn., 10 mM glükoz ve 0.5 mM piruvat) eklenir.
4. % 70 etanol içinde kelepçe, makas ve forseps sterilize edilmesi ve daha sonra steril GKD ₂ O. durulama ile cerrahi aletler hazırlanması
5. , Kalp perfüzyon sistemine açın su banyosu ve sirkülasyon üzerinde sıcaklığını ayarlamak, 6 ml / dak peristaltik pompanın hızını ayarlamak.
6. % 95 O ₂ ile kabarcık KHB/% 5 _CO2 gaz ve çıkış maddesi akış oranı ve (a fiber optik sıcaklık probu ile 37 ° C,) sıcaklığını izlemek. Sistem, gaz ve ısı dengelenmesi için yaklaşık 20 dakika gerektirir.

2. In Vivo İskelet Kaslar konfokal Görüntüleme

1. Pentobarbital (80 mg / kg, ip) ile fare anestezisi. Hayvan, 10-15 dakika içinde cerrahi anestezi (ayak tutam hiçbir yanıt) ulaşmak ve iskelet kaslarının in vivo görüntüleme için yeterli 1-1.5 saat, bu durum kalır.
2. Arka ayaklarında biri tüyleri ve% 70 etanol ile cilt sterilize.
3. Gastroknemius kasları ortaya çıkarmak için kolun dış kenarı boyunca deride bir kesi olun.
4. Keskin bir forseps ile yavaşça epimysium pick up ve makas ile ile bir kesi yapmak. Dahası epimysium kaldırmak ve onun altındaki kas lifleri maruz teşrih.
5. Iskelet içine TMRM bölgesinin in vivo olarak yüklenmesi içinkas, 30 dakika boyunca kas sokmak ve daha sonra gösterge içermeyen çözeltisi ile yıkamak için izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde TMRM (500 nM) içerir.
6. Konfokal mikroskop (Zeiss LSM 510) aşaması ile ilgili yan fare koyun ve açıkta kalan iskelet kası, odacığın alt kısmını oluşturan lamel karşı karşıya olan bir pozisyonda, arka uzuv kısıtlamaktadır. Lamel kas dokusu ve ters objektif (40X yağ) arasında yer almaktadır.
7. Doku ve lamel arasında sıkı bir temas sağlamak için hafifçe aşağı bacak basın. Izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde açıkta kalan kaslar bırakın.
8. Kare başına bir saniye bir örnekleme hızında kayıt iki boyutlu (2B, xy) konfokal görüntüler. Her pikselin şiddeti 8-bit derinliği dijitalize edilir. Genellikle, bir seri tarama 100 kare içerir.
9. > 505 nm de ilk 405 nm'de heyecanlı ve toplayarak ardışık görüntüleri toplayın sonra 488 nm'de çift dalgaboyu excitatio için> 505 nm toplanırkenmt-cpYFP n görüntüleme. Mt-cpYFP ve TMRM üçlü dalga boyu uyarım görüntüleme için, sırasıyla 405, 488 ve 543 nm sıralı uyarma kullanın, ve, 505-545 de 505-545 emisyon toplamak, ve> 560 nm.

3. Perfüze Fare Kalp Eşodaklı Görüntüleme

1. Hemen iskelet kaslarının in vivo görüntüleme ile, heparin (ip) 200 birim ile fare enjekte edilir. On dakika sonra, torakotomi fare euthanize ve hızlı bir şekilde ona bağlı akciğerler ve timus ile kalp kaldırmak.
2. Hızla buz gibi soğuk tampon maddesi içinde akciğer çıkarın. Timus lobları belirlenmesi ve yavaşça çıkan aort maruz geri soyma.
3. Timus çıkarın ve dikkatle herhangi bir çevre doku kaldırarak aorta izole.
4. Aort arkın ilk dalı öncesinde çıkan aorta üst ucunda bir kesim olun.
5. Lümen maruz iki mikro dikiş forseps ile yavaşça aort duvarı tutun ve dikkatle ca üzerine aorta yerleştirinnnula (PE50 tüp). Dikiş hızla aort etrafında bağlı ise aorta bir mikro damar kelepçe ile yerinde tutulur.
6. Kanül ucu aort kökü üzerinde olduğundan emin olmak için forseps ile kanül dikkatle kontrol edin, kelepçesini sökün. Ek bağları yerine kalp tutmak için gerektiğinde eklenir.
7. Peristaltik pompa açın ve 1 ml / dk da kalp serpmek. Kalp perfüzyon üzerine yenerek devam edecektir.
8. Perfüzyon sistemi konumunu ayarlayın ve mikroskop sahnede kalp koydu. Sahne kalbi tutan odasının ısıtılmasını sağlayan bir adaptörü vardır.
9. Kısmen kalp daldırın odası içinde KHB perfüzyon çözeltisi 1 ml ilave edilir. 37 ° C de, bölmenin sıcaklığını izlemek Peristaltik bir pompa kullanılarak odasından çıkış maddesinin çıkarın.
10. Giderek kalp için yeterli akımı (yaklaşık olarak 2 ml / dak) elde etmek için peristaltik bir pompa hızını artırmaktır.
11. Stabilizasyon 10 dakika sonra hea perfüze10 uM Blebbistatin ve 100-500 nM TMRM ile oda sıcaklığı. Kalp atışı 10 dakika sonra yavaşlar.
12. Bölmenin altındaki lamel ile kalbin sıkı bir temas sağlamak için ve ayrıca kalp atışı bastırmak için kalp üzerine hafif bir basınç uygulanır.
13. Yukarıda adım 2.8 'de açıklandığı gibi sağlam miyokardiyumun konfokal görüntüleme için aynı prosedürü uygulayın. Dikkatle mümkün net bir görüntü ortaya odak düzlemi ayarlayın.

4. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

1. Tek mitokondriyal yanıp söner ve membran potansiyeli değişiklikleri analiz etmek konfokal yazılımın "Fizyolojik Analizi" modülü tarafından sağlanan araçlarını kullanın. Bu modül, genellikle konfokal sistemin görüntü edinme yazılım dahil ve görüntüde belli alanların belirlenmesi hem de zaman etiketleri ile floresan yoğunluğunun çıkış izin verir.
2. Veritabanı ve analiz edilecek daha sonra seri 2D görüntü dosyasını açın.
3. "Bölge tıklayınFaiz (ROI) ortalama İB'nin "geçmek için" anlamına ortalamaları İB'nin "modunda" geçmek için "Region of Interest (ROI) demek" modunda. tıklayınız. "
4. Yanıp seçmek için cpYFP 488 nm kanal hariç diğer kanalların ekranını kapatın.
5. Görüntü ve manuel zoom seri 2D görüntüleri oynatmak için kaydırma çubuğunu hareket ettirin.
6. Nerede floresan sinyal artar geçici siteyi bularak tek mitokondriyal süperoksit yanıp tanımlayın. Yanıp işaretlemek için uygun ROI aracını kullanın. Her ROI zaman bağımlı floresan değişimi gösteren iz görüntünün yanında görünecektir.
7. Tüm yanıp seçtikten sonra, diğer kanalların ekranda açın. Arka sinyal çıkarma için hücre dışında görüntü üzerinde bir ROI seçin. Birlikte zaman etiketleri ile çıkış her ROI ortalama floresan.
8. Tarama zaman ve alan ile birlikte seri tarama görüntü dosyasının her basması sayısını kaydedinHücre. Excel kullanın 100 sn / 1,000 mikron ² hücre alanının başına yanıp sayısı olarak flaş frekansı hesaplamak için.
9. Her flaş (genlik, zirve için zaman ve çürüme zaman) parametrelerini hesaplamak için Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) yazılı geliştirilmiş özel bir program kullanın. IDL yazılım ticari olarak mevcuttur ve flaş parametre analizi için özel olarak geliştirilen program, istek üzerine yazar elde edilebilir.

Sonuçlar

Bu protokole göre, tek mitokondriyal olayların in vivo görüntüleme anestezi farelerin iskelet kaslarında yapılabilir perfüze kalp yerinde görüntüleme (Şekil 1) izledi. Görüntüleme koşulları optimum ayarı bozulmamış kas dokularının net görüntüler sağlamak ve tek mitokondri çözünürlük (Şekil 2) ile olacaktır. TMRM genellikle mt-cpYFP konumunu kontrol etmek için kullanılır ve mt-cpYFP sinyali ile tam bir üst üste desen

Tartışmalar

Canlı hayvan veya perfüze organ tek mitokondriyal olayları görüntüleme mitokondrial fonksiyon değerlendirme ^{17,19,21,22,24,25} için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaja sahiptir. Burada anlatılan teknik, hücre içi çözünürlükte gerçek bir fizyolojik duruma mitokondriyal fonksiyon in situ tespiti gerçek zaman elde edilebilir. Sistemik olarak, in vivo olarak belirli bir organ veya hücre tipinde normal fonksiyonu, mitokondri rolünü incelemek için, diğe...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.